Τελ. ενημέρωση:
17-Nov-2000

Αρχ Ελλ Ιατρ, 17(2), Μάρτιος-Απρίλιος 2000, 161-170

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Ανάπτυξη διαγνωστικής μεθόδου για την ανάλυση του γονιδίου BRCA1
σε Ελληνικές οικογένειες με ιστορικό καρκίνου μαστού-ωοθηκών*

E. ΚΩΝΣΤΑΝΤΟΠΟΥΛΟΥ,¹ Χ. ΚΡΟΥΠΗΣ,² Α. ΛΑΔΟΠΟΥΛΟΥ,¹
Α. ΠΑΝΤΑΖΙΔΗΣ,¹ Δ. ΜΠΟΥΜΠΑ,1 Ε. ΛΙΑΝΙΔΟΥ,² M. PETERSEN,³
Λ. ΦΛΩΡΕΝΤΙΝ,⁴ Γ. ΦΟΥΝΤΖΗΛΑΣ,^5,6 Δ. ΓΙΑΝΝΟΥΚΑΚΟΣ¹

¹ Εργαστήριο Μοριακής Διαγνωστικής, Ι/Ρ-ΡΠ, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»
² Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών
³ Τμήμα Γενετικής, Ινστιτούτο Υγείας του Παιδιού
⁴ Κέντρο Μοριακής Βιολογίας και Κυτταρογενετικής ΆλφαLab
⁵ Νοσοκομείο ΑΧΕΠΑ, Ιατρική Σχολή ΑΠΘ
⁶ Ελληνική Συνεργαζόμενη Ογκολογική Ομάδα

ΣΚΟΠΟΣ της παρούσας μελέτης ήταν, αρχικά, η καταγραφή των κυριοτέρων μεταλλάξεων του γονιδίου BRCA1 στον Ελληνικό πληθυσμό και, στη συνέχεια, ο σχεδιασμός διαγνωστικής μεθόδου για το χαρακτηρισμό των μεταλλάξεων αυτών σε ασθενείς ή υγιή άτομα, που ανήκουν σε οικογένειες υψηλού κινδύνου για καρκίνο του μαστού ή των ωοθηκών. ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΣ Αρχικά, απομονώθηκε γενομικό DNA ασθενών που ανήκουν σε οικογένειες με ιστορικό δύο ή περισσοτέρων περιπτώσεων καρκίνου του μαστού σε ηλικία μικρότερη των 50 ετών ή καρκίνου ωοθηκών ανεξαρτήτως ηλικίας. Στη συνέχεια, αναλύθηκε το εξόνιο 11 του γονιδίου BRCA1 με τη μέθοδο ταυτοποίησης θέσεων πρόωρου τερματισμού της πρωτεϊνικής σύνθεσης (Protein Truncation Test, PTT). Τα υπόλοιπα εξόνια αναλύθηκαν με απευθείας ανάγνωση της αλληλουχίας τους. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ταυτοποιήθηκαν 3 παθογόνες μεταλλάξεις, οι 3741insA, 1623del5-ΤΤΑΑΑ και 3099delT, σε σύνολο 19 ασθενών. Σύμφωνα με τα στοιχεία της διεθνούς βάσης δεδομένων BIC, η πρώτη μετάλλαξη έχει καταγραφεί μόνο μία φορά σε μια Tουρκική οικογένεια στη Γερμανία, η δεύτερη έξι φορές και η τρίτη είναι μια νέα μετάλλαξη. Επίσης, ταυτοποιήθηκαν τρεις γνωστοί πολυμορφισμοί του γονιδίου BRCA1, οι Ε1038G (exon 11), P871L (exon 11), S1613G (exon 16), μια γνωστή μετάλλαξη του εσονίου 18 (IVS18+ 65 G>A), καθώς και μια άλλη περιοχή στο εσόνιο 16 με δύο μεταλλάξεις (IVS16-68 G>A, IVS16-92 G>Α), οι οποίες δεν κατηγοριοποιήθηκαν και δεν έχουν αναφερθεί. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η πιλοτική αυτή μελέτη έδειξε ότι (α) παθογόνες μεταλλάξεις του γονιδίου BRCA1 εντοπίζονται και στον Ελληνικό πληθυσμό, (β) γνωστοί πολυμορφισμοί του γονιδίου βρίσκονται και στον Ελληνικό πληθυσμό, (γ) ο συνδυασμός των μεθόδων PTT και αυτόματης ανάγνωσης της αλληλουχίας του DNA καθιστά δυνατή την ανίχνευση σπάνιων μεταλλάξεων σε πολύ σύνθετα γονίδια με σχετικά χαμηλό κόστος και (δ) η μεθοδολογία αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί διαγνωστικά σε οικογένειες με ιστορικό καρκίνου μαστού/ωοθηκών. Λέξεις ευρετηρίου: BRCA1, Οικογενής καρκίνος μαστού, ωοθηκών.

Έχει δειχθεί ότι τα γονίδια BRCA1 και BRCA2 είναι υπεύθυνα για το μεγαλύτερο ποσοστό του οικογενή καρκίνου μαστού/ωοθηκών.1–3 Οι φορείς των κληρονομούμενων μεταλλάξεων στα γονίδια αυτά έχουν ιδιαίτερα αυξημένες πιθανότητες ανάπτυξης καρκίνου του μαστού ή των ωοθηκών. Εκτιμάται ότι, στο γενικό πληθυσμό, 6–7% των περιπτώσεων του καρκίνου του μαστού και 10% του καρκίνου των ωοθηκών οφείλονται σε μεταλλάξεις στα γονίδια προδιάθεσης στον καρκίνο.4 Η συχνότητα εμφάνισης μεταλλάξεων του BRCA1 και BRCA2 σε οικογένειες υψηλού κινδύνου για καρκίνο του μαστού ή των ωοθηκών (ή και των δύο) διαφέρει σε μεγάλο βαθμό, ανάλογα με τον πληθυσμό που μελετάται.5,6 Η συχνότητα των μεταλλάξεων του BRCA1 είναι 1,5–2,0 φορές υψηλότερη από τη συχνότητα των μεταλλάξεων του BRCA2. Οικογένειες υψηλού κινδύνου ορίζονται αυτές στις οποίες τουλάχιστον τρεις συγγενείς (γυναίκες) έχουν προσβληθεί από καρκίνο του μαστού ή εκείνες όπου τη νόσο έχουν εμφανίσει τουλάχιστον δύο συγγενείς, από τους οποίους η μία έχει προσβληθεί από καρκίνο των ωοθηκών ή έχει καταγραφεί ανδρικός καρκίνος του μαστού.

Στην έρευνα των Frank et al, η οποία πραγματοποιήθηκε στις ΗΠΑ, το δείγμα των ασθενών που εξετάστηκαν διαμορφώθηκε με βάση τα παρακάτω κριτήρια: (α) η ηλικία εμφάνισης του καρκίνου του μαστού ήταν πριν τα 50 χρόνια, (β) στην οικογένεια υπήρχε τουλάχιστον μία συγγενής πρώτου ή δεύτερου βαθμού, η οποία είχε προσβληθεί από καρκίνο του μαστού σε ηλικία μικρότερη των 50 ετών ή (γ) στην οικογένεια υπήρχε τουλάχιστον μία συγγενής, η οποία είχε προσβληθεί από καρκίνο των ωοθηκών χωρίς ένδειξη ηλικίας. Εντοπίστηκαν μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 και BRCA2 σε ποσοστό 45% των ασθενών (50 από 101), οι οποίες είχαν τουλάχιστον δύο συγγενείς που είχαν προσβληθεί από καρκίνο μαστού/ωοθηκών, και σε ποσοστό 22% (20 από 89) των ασθενών που είχαν μόνο ένα συγγενή με καρκίνο.7

Σε δύο άλλες μεγάλες κλινικές μελέτες, που πραγματοποιήθηκαν στις ΗΠΑ τη διετία 1995–1996, όπου αποκλειστικό κριτήριο για την επιλογή του δείγματος ήταν η ηλικία εμφάνισης του καρκίνου, η οποία αναδείχθηκε σε παράγοντα πρόβλεψης μεταλλάξεων στο ΒRCA1, βρέθηκε ότι το 8% και το 10% των γυναικών ηλικίας κάτω των 35 και 30 ετών, αντίστοιχα, έφεραν κληρονομούμενες μεταλλάξεις του γονιδίου BRCA1.8,9 Σε μια άλλη πληθυσμιακή μελέτη στις ΗΠΑ αναφέρθηκε ότι, από 208 γυναίκες με καρκίνο του μαστού σε ηλικία μικρότερη των 45 ετών, με οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του μαστού, μόνο 15 (7%) έφεραν μεταλλάξεις του BRCA1.10 Σε αυτή τη μελέτη, το ποσοστό των μεταλλάξεων εξαρτάτο άμεσα από τη μικρή ηλικία των ασθενών με διάγνωση καρκίνου και από τον αριθμό διαγνώσεων καρκίνου μαστού/ωοθηκών στο οικογενειακό ιστορικό. Σε άλλη μελέτη, επίσης στις ΗΠΑ, αναφέρεται ότι μεταλλάξεις του BRCA1 βρέθηκαν μόνο στο 3,3% (4 από 120) των γυναικών με διάγνωση καρκίνου του μαστού σε ηλικία από 20–74 ετών. Το οικογενειακό ιστορικό ήταν ο σημαντικότερος παράγοντας πρόβλεψης των μεταλλάξεων του BRCA1 και, πιο συγκεκριμένα, ο αριθμός των συγγενών που έχουν νοσήσει και η παρουσία καρκίνου των ωοθηκών σε μια συγγενή.¹¹

Από όλες τις παραπάνω πληθυσμιακές έρευνες συνάγεται ότι η παρουσία μετάλλαξης στα γονίδια BRCA1 ή BRCA2 σχετίζεται πρωτίστως με την προσβολή από καρκίνο μαστού/ωοθηκών άλλων μελών της οικογένειας (οικογενειακό ιστορικό). Όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των μελών που έχουν προσβληθεί, τόσο περισσότερες είναι οι πιθανότητες για ύπαρξη μιας κληρονομούμενης μετάλλαξης του BRCA1 ή BRCA2. Επίσης, στις οικογένειες αυτές, σημαντικός παράγοντας πρόβλεψης των μεταλλάξεων είναι η ηλικία εμφάνισης της νόσου. Όσο περισσότερα είναι τα μέλη στην οικογένεια που εμφάνισαν τη νόσο σε νεαρή ηλικία, τόσο περισσότερες είναι και οι πιθανότητες παρουσίας μεταλλάξεων.

Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο BRCA1 αποτελείται από 22 κωδικοποιούμενα και 2 μη κωδικοποιούμενα εξόνια (πίν. 1)^1,2 και συμμετέχει στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου¹² και στον έλεγχο της επιδιόρθωσης του DNA.^13,14 Περισσότερες από 300 μεταλλάξεις του BRCA1 έχουν καταγραφεί παγκοσμίως και καλύπτουν σχεδόν όλο το μήκος της κωδικοποιούμενης περιοχής. Όλες οι καταγεγραμμένες μεταλλάξεις του BRCA1 είναι κληρονομικές και περίπου το 85% αυτών έχουν ως αποτέλεσμα τον πρόωρο τερματισμό της πρωτεϊνικής σύνθεσης (nonsense, frameshift mutations). Σύμφωνα με τις μέχρι σήμερα δημοσιευμένες εργασίες, το 60% των μεταλλάξεων εντοπίζονται στο εξόνιο 11 και περίπου το 20% στα εξόνια 2, 5 και 20.

Το ποσοστό των οικογενειών υψηλού κινδύνου με καρκίνο του μαστού ή των ωοθηκών, που αποδίδεται σε μεταλλάξεις του BRCA1, διαφέρει σημαντικά από τον έναν πληθυσμό στον άλλο.^5,6 Μεταλλάξεις του BRCA1 είναι εξαιρετικά συχνές στη Ρωσία (ανέρχονται στο 79% των οικογενειών υψηλού κινδύνου).^15–17 Το πλέον συχνό αλληλόμορφο στη Ρωσία είναι το 5382insC, το οποίο αντιστοιχεί στην πιο συχνή μετάλλαξη, που απαντά σε όλες τις Ευρωπαϊκές χώρες. Ως προς τη συχνότητα εμφάνισης των μεταλλάξεων του BRCA1 σε άλλες χώρες, ακολουθεί το Ισραήλ, με ποσοστό 47% επί των οικογενειών υψηλού κινδύνου, και η Ιταλία, με ποσοστό 29%. Ενώ στο Ισραήλ παρατηρούνται δύο μόνο μεταλλάξεις (185delAG και 5382insC), στην Ιταλία σχεδόν όλες οι μεταλλάξεις είναι μοναδικές. Στις υπόλοιπες Ευρωπαϊκές χώρες το ποσοστό παρουσίας των μεταλλάξεων κυμαίνεται από 15–25%, με εμφάνιση σημαντικής ετερογένειας στο είδος των μεταλλάξεων, ενώ σε διεθνές επίπεδο, από τα μέχρι σήμερα υπάρχοντα δεδομένα, τα χαμηλότερα ποσοστά σημειώνονται στην Ιαπωνία (10%).

Η παρατηρούμενη, λοιπόν, διαφορετικότητα στη γεωγραφική κατανομή των μεταλλάξεων αναδεικνύει την αναγκαιότητα για εθνικού τύπου μελέτες, έτσι ώστε να καταγραφεί το φάσμα των μεταλλάξεων του γονιδίου αυτού και η συνακόλουθη γνώση να εξυπηρετήσει προληπτικούς και διαγνωστικούς σκοπούς.

Όσον αφορά τις Μεσογειακές χώρες, ολοκληρωμένες μελέτες έχουν γίνει μόνο στην Ιταλία,^18–23 στη Γαλλία^24–26 και στην Ισπανία.^27–32 Στις τρεις αυτές χώρες, οι μεταλλάξεις εντοπίζονται σε όλο το μήκος της κωδικοποιούμενης περιοχής του γονιδίου και ιδιαίτερα στο εξόνιο 11.

Στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν μόνο δύο πρόσφατες (1999) πιλοτικές μελέτες, που αφορούν το χώρο των Βαλκανίων (Γιουγκοσλαβία³³ και Τουρκία³⁴). Στις δύο αυτές χώρες ανιχνεύθηκε η μετάλλαξη 5382insC και τρεις επιπλέον μεταλλάξεις, στα εξόνια 2, 11 και 24.

Σ’ αυτή την εργασία αναλύσαμε το γενομικό DNA 19 ασθενών Ελληνικής καταγωγής με ιστορικό καρκίνου μαστού/ωοθηκών, χρησιμοποιώντας την τεχνική της ανάλυσης πρόωρου τερματισμού της πρωτεϊνικής σύνθεσης και την απευθείας ανάλυση της αλληλουχίας του DNA. Ταυτοποιήθηκαν 3 μεταλλάξεις στο εξόνιο 11, οι οποίες οδηγούν στην αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης. Η πρώτη έχει αναφερθεί μία μόνο φορά στη βάση δεδομένων BIC σε μια Τουρκική οικογένεια που ζει στη Γερμανία, η δεύτερη 6 φορές, ενώ η τρίτη είναι μια καινούρια μετάλλαξη.

Καμία από τις γνωστές ιδρυτικές μεταλλαγές, 185delAG, C61G και 5382insC, δεν εντοπίστηκε μετά από απευθείας ανάλυση της αλληλουχίας των αντίστοιχων εξονίων (2, 5, 20) σε 22, 10 και 26, αντίστοιχα, ασθενείς που ανήκουν σε οικογένειες υψηλού κινδύνου.

Επίσης, ταυτοποιήθηκαν τρεις γνωστοί πολυμορφισμοί του γονιδίου BRCA1 [Ε1038G (exon 11), P871L (exon 11), S1613G (exon 16)], μία ήδη γνωστή μετάλλαξη του εσονίου 18 (IVS18+65 G>A), καθώς και μία περίπτωση μη κατηγοριοποιήσιμη, που φέρει δύο θέσεις μεταλλαγμένες στο εσόνιο 16 και δεν έχει αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία.

Οι παραπάνω παθογόνες μεταλλάξεις εντοπίζονται για πρώτη φορά στον Ελληνικό πληθυσμό. Καμία άλλη δεν έχει καταγραφεί μέχρι σήμερα.

ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ

Οι ασθενείς και οι οικογένειές τους

Σε συνεργασία με Ελληνικά νοσοκομεία έγινε συλλογή γενομικού DNA από ασθενείς που προέρχονταν από οικογένειες, στις οποίες δύο ή περισσότερα μέλη είχαν προσβληθεί από καρκίνο μαστού/ωοθηκών. Τα κριτήρια για τη διαμόρφωση του μελετούμενου δείγματος ήταν η ύπαρξη στην ίδια οικογένεια τουλάχιστον ενός μέλους με συγγένεια πρώτου ή δεύτερου βαθμού με καρκίνο μαστού/ωοθηκών σε ηλικία κάτω των 50 ετών ή η παρουσία καρκίνου των ωοθηκών ανεξαρτήτως ηλικίας. Η επιλογή των ασθενών έγινε μετά από έγγραφη συγκατάθεσή τους για τη μελέτη. Το ιστορικό των διαφόρων οικογενειών αναφέρεται στον πίνακα 2.

Ανίχνευση των μεταλλάξεων

Το γενομικό DNA των ασθενών απομονώθηκε από περιφερικά λεμφοκύτταρα με χρήση των στηλών Qiagen. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν κάλυπταν και τα 22 κωδικοποιούμενα εξόνια του γονιδίου, καθώς επίσης και τις περιοχές σύνδεσης εσονίων και εξονίων. Η επιλογή των εκκινητών έγινε εν μέρει από τη διεθνή βάση δεδομένων BIC, που υπάρχει στο Διαδίκτυο στη διεύθυνση http://www.nhgri.nih.gov/Intramural_ research/Lab_transfer/Bic. Οι υπόλοιποι εκκινητές σχεδιάστηκαν ανάλογα με τις ανάγκες που προέκυπταν κατά τη διάρκεια της μελέτης (πίν. 1). Η αρίθμηση που χρησιμοποιείται αναφέρεται στην αλληλουχία του cDNA του BRCA1 με αριθμό πρόσβασης U1480 στη βάση δεδομένων GenBank.

Στη συνέχεια, το γενομικό DNA ενισχύθηκε με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) σε ένα θερμοκυκλοποιητή Perkin-Elmer 2400 (Perkin Elmer, CA, USA).

Ανάλυση πρόωρου τερματισμού της πρωτεϊνικής σύνθεσης

Το εξόνιο 11 (3,6 kb) ενισχύεται σε τρία τμήματα παρουσία δύο εκκινητών (5΄ και 3΄). Ο εκκινητής 5΄ περιέχει έναν προαγωγέα Τ7 και κατάλληλη αλληλουχία μεταγραφής και μετάφρασης.³⁵ Το προϊόν της ενίσχυσης υποβάλλεται σε αντίδραση μεταγραφής και μετάφρασης χρησιμοποιώντας το in vitro σύστημα δικτυοκυττάρου (Promega). Τα προϊόντα της μετάφρασης αναλύονται σε γέλη πολυακρυλαμιδίου 12%, σταθεροποιούνται, στεγνώνονται και υποβάλλονται σε αυτοραδιογραφία.

Ανάγνωση της αλληλουχίας του DNA

Η αλληλουχία των προϊόντων της PCR αναλύθηκε με χρήση των ίδιων εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την αρχική ενίσχυση. Στις περιπτώσεις όπου κρίθηκε απαραίτητο, αναλύθηκε η αλληλουχία και προς τις δύο κατευθύνσεις. Η ταυτοποίηση όλων των τύπων μεταλλάξεων, που περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη, έγινε μετά από ανάγνωση της αλληλουχίας του DNA και προς τις δύο κατευθύνσεις. Η ανάγνωση της αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε με το kit ABI PRISM DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing στο γενετικό αναλυτή ΑΒΙ310 (Perkin Elmer, Applied Biosystems, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δυνατότητα ανάλυσης του συγκεκριμένου οργάνου είναι περίπου 10.000 βάσεις το 24ωρο.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Παθογόνες μεταλλάξεις

Αρχικά, απομονώθηκε γενομικό DNA από περιφερικά λεμφοκύτταρα 19 ασθενών με καρκίνο μαστού/ωοθηκών, σύμφωνα με τα κριτήρια εισόδου που αναφέρονται στο κεφάλαιο «Υλικό και μέθοδος» (πίν. 2). Η αρχική διαλογή έγινε με εφαρμογή της τεχνικής του ελέγχου για πρόωρο τερματισμό της πρωτεϊνικής σύνθεσης (PTT) στο εξόνιο 11, το οποίο αντιπροσωπεύει περισσότερο από το μισό της κωδικοποιούμενης περιοχής του γονιδίου BRCA1. Στις περιπτώσεις όπου δεν παρατηρήθηκε πρόωρος τερματισμός της πρωτεϊνικής σύνθεσης, αναλύθηκαν τα εξόνια 2, 5 και 20 με απευθείας ανάγνωση της αλληλουχίας τους. Σε δέκα από τους ασθενείς έγινε ανάλυση όλων των υπολοίπων εξονίων με απευθείας ανάγνωση της αλληλουχίας τους. Η ανάλυση κατά PTT οδήγησε στην ταυτοποίηση μικρότερων πρωτεϊνικών παραγώγων, που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του εξονίου 11 (Α, Β, Γ), στις οικογένειες 64, 98, 99 (εικ. 1). Ανάλυση της αλληλουχίας των περιοχών που πιθανόν περιείχαν μεταλλάξεις αποκάλυψε 3 μεταλλάξεις, οι οποίες οδηγούν στην αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης (πίν. 2, εικ. 2). Οι μεταλλάξεις αυτές βρίσκονταν στην ομάδα των οικογενειών με βεβαρημένο ιατρικό ιστορικό ή σε συνδυασμό με περιπτώσεις εμφάνισης καρκίνου μαστού/ωοθηκών σε νεαρή ηλικία. Και οι τρεις αυτές μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στο εξόνιο 11.

Η μετάλλαξη 3741insA προκαλεί πρόωρο τερματισμό της πρωτεϊνικής σύνθεσης στο κωδικόνιο 1218 και βρέθηκε σε μία ασθενή με αμφοτερόπλευρο καρκίνο του μαστού σε ηλικία 31 ετών (οικογένεια 64), με μία μόνο συγγενή δεύτερου βαθμού με καρκίνο του μαστού σε ηλικία 35 ετών. Η μετάλλαξη αυτή έχει αναφερθεί μόνο μία φορά στη βάση δεδομένων BIC, αλλά δεν έχει δημοσιευθεί πουθενά αλλού. Η οικογένεια στην οποία βρέθηκε είναι Τουρκικής καταγωγής και ζει στη Γερμανία.

Η μετάλλαξη 1623del5-TTAAA οδηγεί στον πρόωρο τερματισμό της πρωτεϊνικής σύνθεσης στο κωδικόνιο 505. Η μετάλλαξη αυτή εντοπίστηκε σε μία ασθενή (οικογένεια 98), που ανέπτυξε καρκίνο των ωοθηκών. Στην ίδια οικογένεια υπήρχε μία περίπτωση καρκίνου του μαστού και μία άλλη με καρκίνο του ενδομητρίου. Η μετάλλαξη αυτή αναφέρθηκε αρχικά σε μια Βρετανική οικογένεια³⁶ και στη συνέχεια βρέθηκε και στην Ιταλία¹⁸ και την Ισπανία.³² Μέχρι το Φεβρουάριο του 2000 υπήρχαν 6 αναφορές γι’ αυτή τη μετάλλαξη στη βάση δεδομένων BIC.

Η μετάλλαξη 3099delT είναι μια καινούρια μετάλλαξη, η οποία προκαλεί πρόωρο τερματισμό της πρωτεϊνικής σύνθεσης στο κωδικόνιο 999. Ταυτοποιήθηκε σε μια ασθενή που ανέπτυξε καρκίνο των ωοθηκών σε ηλικία 33 ετών και είναι μέλος οικογένειας υψηλού κινδύνου (Νο 99), με δύο επιπλέον περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών και μία περίπτωση καρκίνου μαστού και ωοθηκών στην ίδια ασθενή. Και οι 4 ασθενείς ήταν συγγενείς πρώτου βαθμού. Για να ελεγχθεί εάν κάποια από τις τρεις αυτές μεταλλάξεις εμφανίζεται με ιδιαίτερη συχνότητα στον Ελληνικό πληθυσμό, αναλύθηκαν 15 επιπλέον ασθενείς με απευθείας ανάγνωση της αλληλουχίας του DNA στα συγκεκριμένα αυτά σημεία του εξονίου 11. Καμία από τις ανωτέρω ασθενείς δεν έφερε τις παραπάνω μεταλλάξεις. Μολονότι ο αριθμός (σύνολο 31 οικογένειες) των ασθενών που αναλύθηκαν για τις συγκεκριμένες μεταλλάξεις είναι σχετικά μικρός, οι μεταλλάξεις αυτές δεν φαίνεται να είναι ιδιαίτερα συχνές.

Επίσης, αναλύθηκαν τα εξόνια 2, 5 και 20, στα οποία έχουν ανιχνευθεί οι ιδρυτικές μεταλλάξεις 185delAG, C61G και 5382insC. Οι μεταλλάξεις αυτές παρουσιάζουν αρκετά υψηλή συχνότητα³⁹ σε χώρες της Κεντρικής, Ανατολικής και Νότιας Ευρώπης, όπως η Ουγγαρία,¹⁶ η Πολωνία,⁴⁰ η Γιουγκοσλαβία,³³ η Λετονία,³⁷ η Ρωσία,¹⁷ η Ιταλία²³ και η Ισπανία.²⁹ Ειδικά η μετάλλαξη 5382insC είναι η πιο κοινή μετάλλαξη σε Ευρωπαϊκούς πληθυσμούς, ενώ υπάρχει ιδιαίτερα υψηλή συχνότητά της σε οικογένειες Ουγγρικής καταγωγής με καρκίνο του μαστού και οικογένειες Ρωσικής καταγωγής με καρκίνο των ωοθηκών. Καμία από τις τρεις αυτές ιδρυτικές μεταλλάξεις δεν βρέθηκε στο γενομικό DNA των ασθενών Ελληνικής καταγωγής. Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι το φάσμα των μεταλλάξεων, τουλάχιστον όσον αφορά τις τρεις αυτές μεταλλάξεις, στον Ελληνικό πληθυσμό πρέπει να είναι αρκετά διαφορετικό από εκείνο που έχει αναφερθεί σε άλλες Ευρωπαϊκές χώρες.

Πολυμορφισμοί

Ταυτοποιήθηκαν τρεις γνωστοί πολυμορφισμοί, οι A3232G (Glu1038Gly), C2731T (Pro871Leu) στο εξόνιο 11 και Α4956G (Ser1613Gly) στο εξόνιο 16. Όσον αφορά τη μετάλλαξη Ε1038G, αναλύθηκαν 44 ασθενείς και βρέθηκαν 24 ετεροζυγώτες (55%), 5 ομοζυγώτες (11%) και 15 (34%) που φέρουν και τα δύο φυσιολογικά αλληλόμορφα. Σε υγιή άτομα, οι αντίστοιχες τιμές ήταν 16 (39%), 4 (10%) και 21 (51%). Όσον αφορά τα δείγματα των ασθενών, η συχνότητα του φυσιολογικού αλληλόμορφου προς το μεταλλαγμένο υπολογίστηκε σε 0,61/0,39. Οι αντίστοιχες τιμές για τα δείγματα υγιών ατόμων είναι 0,71/0,29. Θα πρέπει να τονισθεί ότι οι τρεις παραπάνω μεταλλάξεις βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης, με αποτέλεσμα να εμφανίζονται ουσιαστικά σε πολύ συγκρίσιμες συχνότητες. Οι ανωτέρω τιμές συμφωνούν με τις συχνότητες που έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία σε διάφορες χώρες.^38,41–43 Μολονότι οι πολυμορφισμοί αυτοί από μόνοι τους δεν συσχετίζονται άμεσα με τη νόσο, έχει προταθεί από τους Janezic et al⁴³ ότι μπορεί να συμβάλλουν στην εκδήλωση της νόσου σε συνδυασμό με άλλες παθογόνες μεταλλάξεις.

Μεταλλάξεις εσονίων

Μια επιπλέον μετάλλαξη, η οποία ανιχνεύθηκε στο εσόνιο 18 (IVS18+65 G>A), έχει ήδη καταγραφεί στη βάση δεδομένων BIC. Δύο ασθενείς έφεραν μεταλλάξεις στο εσόνιο 16 (IVS16-68, IVS16-92). Οι μεταλλάξεις αυτές των εσονίων είναι δύσκολο να κατηγοριοποιηθούν, δεδομένου ότι το δυνητικό αποτέλεσμά τους στη λειτουργία του γονιδίου μπορεί να είναι είτε σημαντικό είτε απολύτως ασήμαντο. Για το λόγο αυτό, θα πρέπει να γίνουν επιπλέον λειτουργικές μελέτες για την έκφραση του mRNA των συγκεκριμένων ασθενών, δεδομένου ότι οι μεταλλάξεις εσονίων έχουν συχνά ως αποτέλεσμα διαφορετικού τύπου μάτισμα (splicing) του mRNA, με τελικό αποτέλεσμα την παραγωγή ανενεργού πρωτεΐνης. Δεδομένου ότι οι δύο αυτές μεταλλαγές του εσονίου 16 δεν έχουν εντοπιστεί σε άλλους πληθυσμούς μέχρι σήμερα, είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία νέων απλοτύπων του γονιδίου BRCA1, ειδικών για τον Ελληνικό πληθυσμό.

Συμπερασματικά, σε αυτή την πιλοτική μελέτη σε Ελληνικές οικογένειες με ιστορικό καρκίνου μαστού/ωοθηκών ταυτοποιήθηκαν 3 παθογόνες μεταλλάξεις στο εξόνιο 11 του γονιδίου BRCA1. Είναι οι πρώτες μεταλλάξεις που εντοπίζονται στον Ελληνικό πληθυσμό. Παρότι ο αριθμός των οικογενειών που μελετήθηκαν είναι μικρός, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η συχνότητα των μεταλλάξεων του γονιδίου BRCA1 στον Ελληνικό πληθυσμό είναι σχετικά υψηλή, ακόμα και σε οικογένειες μέτριου κινδύνου. Πρέπει να σημειωθεί ότι οι οικογένειες που συμπεριλαμβάνονταν στη μελέτη ήταν μέτριου (2 μέλη) και υψηλού (3 μέλη και άνω) κινδύνου. Ανάλυση ενός μεγαλύτερου αριθμού οικογενειών είναι σε εξέλιξη, για να καθοριστεί το φάσμα των μεταλλάξεων του γονιδίου BRCA1 στην Ελλάδα. Επίσης, βρίσκεται σε εξέλιξη ανίχνευση μεταλλάξεων του BRCA2 στις οικογένειες εκείνες όπου δεν παρατηρήθηκε καμία μετάλλαξη στο BRCA1.

Όσον αφορά τη μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε, ο συνδυασμός της τεχνικής του πρόωρου τερματισμού της πρωτεϊνικής σύνθεσης με απευθείας αυτόματη ανάλυση της αλληλουχίας του γενομικού DNA μπορεί, σε σχετικά μικρό χρονικό διάστημα και με μέτριο κόστος, να δώσει πολύ έγκυρα αποτελέσματα.

Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης μπορεί να αποτελέσουν τη βάση για την ανάπτυξη διαγνωστικής μεθόδου για την ανάλυση της προδιάθεσης για καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών σε οικογένειες με βεβαρημένο ιστορικό για το συγκεκριμένο τύπο καρκίνου. Η ανάπτυξη των εξετάσεων αυτών σε κλινικό επίπεδο θα πρέπει να συνδυαστεί με την παράλληλη καθιέρωση του θεσμού του γενετικού συμβούλου.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Οι συγγραφείς αισθάνονται την ανάγκη να ευχαριστήσουν τους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. MIKI W, SWENSEN J, SHATTUCK-EIDENS D, FUTREAL PA, HARSHMAN K, TAVTIGIAN S ET AL. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. Science 1994, 226:66–71
2. FUTREAL PA, LIU Q, SHATTUCK-EIDENS D, COCHRAN C, HARSHMAN K, TAVTIGIAN S ET AL. BRCA1 mutations in primary breast and ovarian carcinomas. Science 1994, 266:120–122
3. WOOSTER R, BIGNELL G, LANCASTER J, SWIFT S, SEAL S, MANGION J ET AL. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nature 1995, 378:789–792
4. CLAUS EB, SCHILDKRAUT JM, THOMPSON WD, RISCH NJ. The genetic attributable risk of breast and ovarian cancer. Cancer 1996, 77:2318–2324
5. SZABO CI, KING MC. Population genetics of BRCA1 and BRCA2. Am J Hum Genet 1997, 60:1013–1020
6. NEUHAUSEN SL. Ethnic differences in cancer risk resulting from genetic variation. Cancer 1999, 86:2575–2582
7. FRANK TS, MANLEY SA, OLOPADE OI, CUMMINGS S, GARBER JE, BERNHARDT B ET AL. Sequence analysis of BRCA1 and BRCA2: correlation of mutations with family history and ovarian cancer risk. J Clin Oncol 1998, 16:2417–2425
8. FITZGERALD MG, MACDONALD DJ, KRAINER M, HOOVER I, O’NEIL E, UNSAL H ET AL. Germ-line BRCA1 mutations in Jewish and non-Jewish women with early-onset breast cancer. N Engl J Med 1996, 334:143–149
9. LANGSTON AA, MALONE KE, THOMPSON JD, DALING JR, OSTRANDER EA. BRCA1 mutations in a population-based sample of young women with breast cancer. N Engl J Med 1996, 334:137–142
10. MALONE KE, DALING JR, THOMPSON JD, O’BRIEN CA, FRANCISCO LV, OSTRANDER EA. BRCA1 mutations and breast cancer in the general population: analyses in women before age 35 years and in women before age 45 years with first-degree family history. JAMA 1998, 279:922–929
11. NEWMAN B, MU H, BUTLER LM, MILLIKAN RC, MOORMAN PG, KING MC. Frequency of breast cancer attributable to BRCA1 in a population-based series of American women. JAMA 1998, 279:915– 921
12. LARSON JS, TONKINSON JL, LAI MT. A BRCA1 mutant alters G2-M cell cycle control in human mammary epithelial cells. Cancer Res 1997, 57:3351–3355
13. CORTEZ D, WANG Y, QIN J, ELLEDGE SJ. Requirement of ATM-dependent phosphorylation of BRCA1 in the DNA damage response to double-strand breaks. Science 1999, 286:1162–1166
14. SCULLY R, CHEN J, PLUG A, XIAO Y, WEAVER D, FEUNTEUN J ET AL. Association of BRCA1 with Rad51 in mitotic and meiotic cells. Cell 1997, 88:265–275
15. RAMUS SJ, FRIEDMAN LS, GAUTHER SA, PONDER BA, BOBROW L, VAN DER LOOJI M ET AL. A breast/ovarian cancer patient with germline mutations in both BRCA1 and BRCA2. Nat Genet 1997, 15:14– 15
16. RAMUS SJ, KOTE-JARAI Z, FRIEDMAN LS, VAN DER LOOIJ M, GAUTHER SA, CSOKAY B ET AL. Analysis of BRCA1 and BRCA2 mutations in Hungarian families with breast-ovarian cancer. Am J Hum Genet 1997, 60:1242–1246
17. GAYTHER SA, HARRINGTON P, RUSSELL P, KHARKEVICH G, GARKAVTSEVA RF, PONDER BA. Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia. Am J Hum Genet 1997, 60:1239–1242
18. DE BENEDETTI VM, RADICE P, PASINI B, STAGI L, PENSOTTI V, MONDINI P ET AL. Characterization of ten novel and 13 recurring BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Italian breast and/or ovarian carcinoma patients. Mutations in brief No 178. Online. Hum Mutat 1998, 12:1–5
19. SANTAROSA M, DOLCETTI R, MAGRI MD, CRIVELLARI D, TIBILETTI MG, GALLO A ET AL. BRCA1 and BRCA2 genes: role in hereditary breast and ovarian cancer in Italy. Int J Cancer 1999, 83:5–9
20. MONTAGNA M, SANTACATTERINA M, TORRI A, MENIN C, ZULLATO D, CHIECO-BIANCHI L ET AL. Identification of a 3 kb Alu-mediated BRCA1 gene rearrangement in two breast/ovarian cancer families. Oncogene 1999, 18:4160–4165
21. SANTAROSA M, VIEL A, DOLCETTI R, CRIVELLARI D, MAGRI MD, PIZ ZICHETTA MA ET AL. Low incidence of BRCA1 mutations among Ita lian families with breast and ovarian cancer. Int J Cancer 1998, 78: 581–586
22. MONTAGNA M, SANTACATTERINA M, CORNEO B, MENIN C, SEROVA O, LENOIR GM ET AL. Identification of seven new BRCA1 germline mutations in Italian breast and breast/ovarian cancer families. Cancer Res 1996, 56:5466–5469
23. CALIGO MA, GHIMENTI C, CIPOLLINI G, RICCI S, BRUNETTI I, MARCHETTI V ET AL. BRCA1 germline mutational spectrum in Italian families from Tuscany: a high frequency of novel mutations. Oncogene 1996, 13:1483–1488
24. LAPLACE-MARIEZE V, PRESNEAU N, SYLVAIN V, KWIATKOWSKI F, LOR THOLARY A, HARDOUIN A ET AL. Systematic sequencing of the BRCA-1 coding region for germ-line mutation detection in 70 French high-risk families. Int J Oncol 1999, 14:971–977
25. STOPPA-LYONNET D, LAURENT-PUIG P, ESSIOUX L, PAGES S, ITHIER G, LIGOT L ET AL. BRCA1 sequence variations in 160 individuals referred to a breast/ovarian family cancer clinic. Institut Curie Breast Group. Am J Hum Genet 1997, 60:1021–1030
26. EISINGER F, ALBY N, BREMOND A, DAUPLAT J, ESPIE M, JANIAUD P ET AL. Recommendations for medical management of hereditary breast and ovarian cancer: the French National Ad Hoc Committee. Ann Oncol 1998, 9:939–950
27. DIEZ O, CORTES J, DOMENECH M, BRUNET J, DEL RIO E, PERICAY C ET AL. BRCA1 mutation analysis in 83 Spanish breast and breast/ ovarian cancer families. Int J Cancer 1999, 83:465–469
28. DIEZ O, OSORIO A, ROBLEDO M, BARROSO A, CORTES J, DOMENECH M ET AL. Prevalence of BRCA1 and BRCA2 Jewish mutations in Spanish breast cancer patients. Br J Cancer 1999, 79:1302– 1303
29. DIEZ O, DOMENECH M, ALONSO MC, BRUNET J, SANZ J, CORTES J ET AL. Identification of the 185delAG BRCA1 mutation in a Spanish Gypsy population. Hum Genet 1998, 103:707–708
30. OSORIO A, ROBLEDO M, SAN ROMAN JM, ALBERTOS J, ANDRADE J, BARABASH A ET AL. Mutation analysis of the BRCA2 gene in breast/ovarian cancer Spanish families: identification of two new mutations. Cancer Lett 1997, 121:115–118
31. OSORIO A, ROBLEDO M, ALBERTOS J, DIEZ O, ALONSO C, BAIGET M ET AL. Molecular analysis of the six most recurrent mutations in the BRCA1 gene in 87 Spanish breast/ovarian cancer families. Cancer Lett 1998, 123:153–158
32. BLESA JR, GARCIA JA, OCHOA E. Frequency of germ-line BRCA1 mutations among Spanish families from a Mediterranean area. Mutation in brief No 305. Online. Hum Mutat 2000 15:381–382
33. PAPP J, RAICEVIC L, MILASIN J, DIMITRIJEVIC B, RADULOVIC S, OLAH E. Germline mutation analysis of BRCA1 and BRCA2 genes in Yugoslav breast/ovarian cancer families. Oncol Rep 1999, 6:1435– 1438
34. BALCI A, HUUSKO P, PAAKKONEN K, LAUNONEN V, UNER A, EKMECKI A ET AL. Mutation analysis of BRCA1 and BRCA2 in Turkish cancer families: a novel mutation BRCA2 3414del4 found in male breast cancer. Eur J Cancer 1999, 35:707–710
35. HOGERVORST FB, CORNELIS RS, BOUT M, VAN VLIET M, OOSTERWIJK JC, OLMER R ET AL. Rapid detection of BRCA1 mutations by the protein truncation test. Nat Genet 1995, 10:208–212
36. SCHOFIELD AC, HAITES NE. Novel 5 bp germline deletion in exon 11 of the BRCA1 gene. Hum Mutat 1998, (Suppl 1):S187–S188
37. CSOKAY B, TIHOMIROVA L, STENGREVICS A, SINICKA O, OLAH E. Strong founder effects in BRCA1 mutation carrier breast cancer patients from Latvia. Mutation in brief No 258. Online. Hum Mutat 1999, 14:92
38. INOUE R, FUKUTOMI T, USHISIMA T, MATSUMOTO Y, SUGIMURA T, NAGAO M. Germline mutation of BRCA1 in Japanese breast cancer families. Cancer Res 1995, 55:3521–3524
39. OLAH E. Molecular cancer genetics in eastern and central Europe. Dis Markers 1999, 15:75–77
40. SOBCZAK K, KOZLOWSKI P, NAPIERALA M, CZARNY J, WOZNIAK M, KAPUSCINSKA M ET AL. Novel BRCA1 mutations and more frequent intron-20 alteration found among 236 women from Western Poland. Oncogene 1997, 15:1773–1779
41. DUNNING AM, CHIANO M, SMITH NR, DEARDEN J, GORE M, OAKES S ET AL. Common BRCA1 variants and susceptibility to breast and ovarian cancer in the general population. Hum Mol Genet 1997, 6:285–289
42. DUROCHER F, SHATTUCK-EIDENS D, McCLURE M, LABRIE F, SKOLNICK MH, GOLDGAR DE ET AL. Comparison of BRCA1 polymorphisms, rare sequence variants and/or missense mutations in unaffected and breast/ovarian cancer populations. Hum Mol Genet 1996, 5:835–842
43. JANEZIC SA, ZIOGAS A, KRUMROY LM, KRASNER M, PLUMMER SJ, COHEN P ET AL. Germline BRCA1 alterations in a population-based series of ovarian cancer cases. Hum Mol Genet 1999, 8:889– 897