Τελ. ενημέρωση:
28-Sep-2000

Αρχ Ελλ Ιατρ, 16(6), Νοέμβριος-Δεκέμβριος 1999, 580-589

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Συσχέτιση των πρωτεϊνών bcl-2 και bax με την απόπτωση
στα αδενώματα της υπόφυσης του ανθρώπου

Δ. ΣΑΜΠΑΖΙΩΤΗΣ,¹ Γ. ΚΟΝΤΟΓΕΩΡΓΟΣ,¹ Ν. ΚΑΠΡΑΝΟΣ^2
1Παθολογοανατομικό Εργαστήριο, ΠΓΝΑ «Γεώργιος Γεννηματάς»
²Μονάδα Μοριακής Παθολογικής Ανατομικής, Νοσοκομείο «Αμαλία Φλέμινγκ»

Η απόπτωση ή «προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος» αποτελεί φαινόμενο με μορφολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά, που διαφέρουν από την τυπική νέκρωση.^1–4 Απαντά σε διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένων και των νεοπλασματικών εξεργασιών.⁵

Στον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο εμπλέκονται πολλαπλά γονίδια, τα πρωτεϊνικά προϊόντα των οποίων δρουν ως μοριακοί ρυθμιστές που καθορίζουν το θάνατο ή τη ζωή του κυττάρου μετά από την επίδραση ενός ερεθίσματος. Πολλά από τα γονίδια αυτά είναι ομόλογα μεταξύ διαφόρων ειδών εμβίων όντων, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι βασικοί ρυθμιστικοί μηχανισμοί της απόπτωσης έχουν διατηρηθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Μια από τις κύριες οικογένειες των ανωτέρω γονιδίων είναι αυτή του ογκογονιδίου bcl-2. H bcl-2 είναι μια πρωτεΐνη 24–26 kd, που εντοπίζεται κυρίως στην εξωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων και ανακαλύφθηκε αρχικά ως γονιδιακή έκφραση χρωμοσωματικής αντιμετάθεσης στο οζώδες λέμφωμα.⁶ Η bcl-2 βρέθηκε ότι συμβάλλει στη νεοπλασματική αύξηση, αναστέλλοντας την απόπτωση,⁷ που προάγεται από ορμόνες και κυτταροκίνες, με αποτέλεσμα να παρατείνεται η ζωή του κυττάρου.⁸ Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η bcl-2 αναστέλλει την έκλυση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια,^9–10 το οποίο απαιτείται για την ενεργοποίηση των κασπασών/ICE πρωτεασών, που είναι απαραίτητες στην απόπτωση.¹¹

Έχουν αναγνωριστεί αρκετά μόρια ομόλογα της bcl-2, ορισμένα από τα οποία (bcl-xL, mcl-1 και ced-9) αναστέλλουν επίσης την απόπτωση, ενώ άλλα (bcl-xS, bad, bak και bax) την ευοδώνουν. Η ενεργός ισορροπία μεταξύ των αναστολέων και ευοδωτών της δράσης της bcl-2 αποτελεί έναν από τους κύριους ρυθμιστικούς μηχανισμούς του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου.^12,13

Η baχ (bcl-2-associated protein X) είναι η πρώτη πρωτεΐνη που βρέθηκε να εμφανίζει ομολογία με την bcl-2 σε δύο εξελικτικά διατηρούμενες περιοχές.¹⁴ Η bax μπορεί να αυτοδιμεριστεί με το ίδιο το μόριο (ομοδιμερές) ή με την bcl-2 (ετεροδιμερές) και όταν υπερπαράγεται, τα ομοδιμερή της προάγουν την απόπτωση.^12,15 Αντίθετα, όταν η bcl-2 είναι σε περίσσεια, τα ομοδιμερή της επικρατούν και τα κύτταρα προστατεύονται από τον κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, η bcl-2 αναστέλλει την απόπτωση, χωρίς αντίστοιχη αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και ρυθμίζει αρνητικά την αποπτωτική δράση της bax με το σχηματισμό bcl-2/bax ετεροδιμερών.¹⁵ Η αναλογία, επομένως, των bcl-2/bax αποτελεί ένα ρυθμιστή που ελέγχει το θάνατο ενός κυττάρου ως απάντηση σε ένα αποπτωτικό ερέθισμα.¹⁶ Χαμηλή έκφραση της πρωτεΐνης bax στα κύτταρα καρκινώματος μαστού θεωρείται ότι συμβάλλει στην εξέλιξη της νόσου,¹⁷ ενώ ποντίκια με ανεπάρκεια της bax αναπτύσσουν λεμφοειδή υπερπλασία, αλλά παραδόξως και θάνατο των γεννητικών κυττάρων.¹⁸ Τα στοιχεία αυτά υποδηλώνουν ότι η bax μπορεί να επάγει ή να αναστέλλει τον κυτταρικό θάνατο ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου στο οποίο εκφράζεται, σε συνδυασμό με την παρουσία ή ενεργοποίηση και άλλων μελών της οικογένειας bcl-2. Απώλεια επίσης της bax προάγει την ογκογένεση στα ποντίκια¹⁹ και πιθανώς στους ανθρώπους.²⁰ Μελέτες του mRNA και της πρωτεΐνης bax έχουν δείξει ότι το μόριο αυτό εκφράζεται ευρέως στους ιστούς σε σχέση με την bcl-2, στοιχείο που υποδηλώνει ότι η bax έχει και άλλες λειτουργίες εκτός από την αναστολή της δράσης της bcl-2.^21,22 Για παράδειγμα, η bax έχει αποδειχθεί πως επάγεται άμεσα από το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53, μέσω μεταγραφικής ενεργοποίησης, σε κύτταρα ευαίσθητα στην ακτινοβολία και πιθανώς να παίζει κάποιο ρόλο στην αποπτωτική εξάλειψη των κυττάρων μετά την έκθεσή τους σε παράγοντες που προκαλούν βλάβη του DNA.²³

Αν και το φάσμα των κυτταρικών μεταβολών της απόπτωσης με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο είναι χαρακτηριστικό, είναι δύσκολο να αναγνωριστεί με ακρίβεια ο θάνατος μεμονωμένων κυττάρων με το οπτικό μικροσκόπιο. Η ανίχνευση του κατακερματισμένου ενδονουκλεοσωματικού DNA με την τεχνική της in situ σήμανσης των τελικών υδροξυλομάδων (ISEL)^24,25 και η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση των προϊόντων των γονιδίων bcl-2 και bax αντιπροσωπεύουν μια εναλλακτική προσέγγιση της μελέτης της απόπτωσης. Αυτό μπορεί να προσφέρει σημαντικές πληροφορίες γύρω από την αποπτωτική κατάσταση και τη ρύθμιση της απόπτωσης. Στα αδενώματα της υπόφυσης το φαινόμενο αυτό παραμένει ακόμα ανεξερεύνητο, δεδομένου ότι οι υπάρχουσες μελέτες είναι περιορισμένες και έχουν κατεξοχήν ερευνητικό περιεχόμενο.

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η εκτίμηση των επιδράσεων των πρωτεϊνικών προϊόντων του ογκογονιδίου bcl-2 και του γονιδίου bax και η συσχέτισή τους με την αποπτωτική κατάσταση των αδενωμάτων της υπόφυσης του ανθρώπου.

ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ

Περιπτώσεις

Μελετήθηκαν 81 χειρουργικώς εξαιρεθέντα υποφυσιακά αδενώματα, που συγκεντρώθηκαν από το αρχείο όγκων υπόφυσης του Παθολογοανατομικού Τμήματος του ΠΓΝΑ «Γ. Γεννηματάς». Η διάγνωση βασίστηκε στην ιστολογική μελέτη και ανοσοϊστοχημική ανάλυση για όλες τις αδενοϋποφυσιακές ορμόνες. Για την περαιτέρω ακριβή μορφολογική ταξινόμηση, επιλεγμένα δείγματα μελετήθηκαν στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Οι 60 περιπτώσεις λειτουργικών αδενωμάτων περιελάμβαναν 19 σωματοτρόπα, 16 γαλακτοτρόπα, 10 μικτά σωματοτρόπα-γαλακτοτρόπα και 15 κορτικοτρόπα αδενώματα, ενώ οι λοιπές 21 αφορούσαν κλινικώς μη λειτουργικά αδενώματα. Επιπλέον, μελετήθηκαν 3 μη νεοπλασματικές υποφύσεις προε ρχόμενες από υλικό νεκροτομών. Σαράντα πέντε από τους ασθενείς ήταν άνδρες και 36 γυναίκες. Ο μέσος όρος ηλικίας ήταν 49,93 (εύρος 14–73) έτη στους άνδρες και 44,37 (εύρος 18–65) έτη στις γυναίκες. Στα λειτουργικά αδενώματα, τα επίπεδα των αντίστοιχων υπερπαραγομένων αδενοϋποφυσιακών ορμονών ήταν κατά κανόνα αυξημένα στον ορό όλων των ασθενών. Ένας ασθενής με μικτό σωματοτρόπο-γαλακτοτρόπο αδένωμα έπασχε από πολλαπλή ενδοκρινή νεοπλασία τύπου 1. Επιπλέον, δύο ασθενείς με κορτικοτρόπα αδενώματα είχαν σύνδρομο Nelson, ενώ οι υπόλοιποι από την ίδια ομάδα είχαν διαγνωστεί με νόσο Cushing. Οι ασθενείς με μη λειτουργικά αδενώματα εμφάνιζαν κυρίως κεφαλαλγίες και οπτικές διαταραχές.

Το μέγεθος του όγκου ήταν γνωστό σε 77 περιπτώσεις. Εννέα από τους 56 λειτουργικούς όγκους ήταν μικροαδενώματα, με μέγεθος κάτω του 1 cm, ενώ οι υπόλοιποι 47, όπως και οι 21 μη λειτουργικοί όγκοι, ήταν μακροαδενώματα. Πληροφορίες που αφορούσαν τη φαρμακευτική αγωγή των ασθενών με σωματοτρόπα, γαλακτοτρόπα και μικτά σωματοτρόπα-γαλακτοτρόπα αδενώματα πριν από τη χειρουργική επέμβαση ήταν διαθέσιμες σε 27 περιπτώσεις. Από αυτούς, 23 ασθενείς είχαν λάβει προεγχειρητική αγωγή. Οι ασθενείς με αδενώματα που υπερέκκριναν GH είχαν λάβει ανάλογα σωματοστατίνης (οκτρεοτίδη), ενώ αυτοί που παρήγαγαν PRL είχαν αντιμετωπιστεί με αγωνιστές της ντοπαμίνης (κυρίως βρωμοκρυπτίνη).

Ιστολογική μελέτη

Για την ιστολογική μελέτη, ο ιστός από το αδένωμα που εξαιρέθηκε κατά την επέμβαση, μονιμοποιήθηκε σε διάλυμα 4% ουδέτερης φορμόλης, αφυδατώθηκε σε ανιούσες συγκεντρώσεις αλκοόλης, διαυγάστηκε σε ξυλόλη και στη συνέχεια εμπεδώθηκε και εγκλείστηκε σε παραφίνη. Τομές πάχους 4–6 μm επιστρώθηκαν σε πλακίδια προεργασμένα με κόλλα Vectabond (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) και χρώστηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη και με την ιστοχημική μέθοδο PAS.

Ανοσοϊστοχημική μελέτη

Για την ανοσοϊστοχημική μελέτη, χρησιμοποιήθηκε η κλασική τεχνική του συμπλέγματος αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (ABC) σε τομές παραφίνης (Elite Vectastain ABC, Vector). Χρησιμοποιήθηκαν πολυκλωνικοί αντιοροί έναντι όλων των βασικών αδενοϋποφυσιακών ορμονών ή των α- και β-υπομονάδων (SU) των γλυκοπρωτεϊνικών ορμονών: GH (1:4000), PRL (1:3000), κορτικοτροπίνης (ACTH, 1:2000), β-θυρεοειδοτρόπου ορμόνης (β-TSH, 1:2000), β-θυλακιοτρόπου ορμόνης (β-FSH, 1:2000), β-ωχρινοτρόπου ορμόνης (β-LH, 1:2000) και α-SU (1:2000). Για την επανάκτηση της αντιγονικότητας, προ της εφαρμογής του κύριου αντιορού οι τομές επωάστηκαν σε 0,25 mg/mL διάλυμα προνάσης (Sigma Co, St. Louis, MO, USA) για 5 min, σε θερμοκρασία δωματίου.

Για την ανοσοϊστοχημική μελέτη της έκφρασης των πρωτεϊνών bcl-2 και bax, προηγήθηκε ειδικό πρωτόκολλο προεργασίας των τομών για την επανάκτηση της αντιγονικότητας, με επώασή τους σε διάλυμα 0,2% κιτρικού οξέος σε PBS (pH 6,0) για 1 min σε χύτρα πιέσεως. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης bcl-2 (1:350, κλώνος 124, DAKO, Copenhagen, Denmark) και πολυκλωνικός αντιορός έναντι της πρωτεΐνης bax (1:1500, Pharmingen, San Diego, CA, USA). Ως θετικοί μάρτυρες για την bcl-2 χρησιμοποιήθηκαν φυσιολογικοί λεμφαδένες και οζώδες Β μη-Hodg kin λέμφωμα και για την bax φυσιολογικό επιθήλιο μαζικού αδένα και πορογενές καρκίνωμα μαστού.

Η ανοσοϊστοχημική μέθοδος περιελάμβανε τα εξής: Προετοιμασία των τομών με αποπαραφίνωση σε κλίβανο 56 °C για 12 ώρες και ξυλόλη, ενυδάτωση σε κατιούσες συγκεντρώσεις αλκοόλης και εκπλύσεις σε νερό βρύσης, φυσιολογικό ορό και PBS (phosphate buffer saline, pH 7,6). Ακολούθησε εξουδετέρωση της δράσης της ενδογενούς υπεροξειδάσης με επώαση σε διάλυμα 3% Η₂Ο₂ για 20 min σε σκοτεινό θάλαμο, εκπλύσεις σε PBS και εφαρμογή του πρωτοκόλλου επανάκτησης της αντιγονικότητας. Οι τομές, αφού εκπλύθηκαν σε PBS, επωάστηκαν για 20 min σε ορό ίππου ή ορό αίγας, για μονοκλωνικά και πολυκλωνικά αντισώματα αντίστοιχα, και ακολούθησε επώαση για 16 τουλάχιστον ώρες με το κύριο αντίσωμα, στους 4 °C σε υγρό περιβάλλον. Ακολούθησαν ενδιάμεσες εκπλύσεις με PBS και επώαση με το συνδεδεμένο με βιοτίνη δευτερογενές αντίσωμα για 40 min και με το διάλυμα συμπλέγματος αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης για 30 min. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν για 4 min σε διάλυμα 0,06% χρωμογόνου 3,3-διαμινοβενζιδίνης (Sigma) σε PBS και 1 μL/mL H₂O₂, που έδωσε μια έντονη καφέ χρώση στις θέσεις σύνδεσης αντιγόνου-αντισώματος. Τέλος, ακολούθησε αντίχρωση με αιματοξυλίνη Harris για 2 min, ανιούσα αφυδάτωση, διαύγαση, επίστρωση με Eukitt (O. Kinder Gmbh & Co, Freiburg, Germany) και επικάλυψη των τομών.

Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

Για την υπερμικροσκοπική μελέτη, επιλεγμένα ιστοτεμαχίδια διαμέτρου περίπου 0,2–0,3 cm από το νωπό υλικό του αδενώματος μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα 2,5% γλουταραλδεΰδης, σε Sorensen’s buffer για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα ιστοτεμαχίδια εκπλύθηκαν σε Sorensen’s buffer για 40 min, επαναμονιμοποιήθηκαν σε τετροξείδιο του οσμίου σε σκοτεινό περιβάλλον για 1 ώρα, εκπλύθηκαν με Millioning’s buffer για 40 min, αφυδατώθηκαν σε αλκοόλες, διαποτίστηκαν με οξείδιο του προπυλενίου και εμπεδώθηκαν σε μίγμα εποξικών ρητινών (Epon-Araldite). Ημίλεπτες τομές από τους κώνους πλαστικού χρώστηκαν με 1% κυανού της τολουϊδίνης και επιλέχθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο οι κατάλληλες θέσεις για υπερμικροσκοπική μελέτη. Υπέρλεπτες τομές από τους επιλεγμένους κώνους πλαστικού χρώστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο. Η μελέτη και φωτογράφηση αντιπροσωπευτικών θέσεων έγινε με τη χρήση διαβιβαστικού μικροσκοπίου τύπου Philips 410LS ή JEM-100CX2 (JEOL Ltd, Tokyo, Ja pan). Λεπτομέρειες από τις παραπάνω μεθόδους έχουν περιγραφεί σε προηγούμενη μελέτη.²⁶

Η υπερμικροσκοπική μελέτη αφορούσε 5 σωματοτρόπα, 3 γαλακτοτρόπα, 3 μικτά σωματοτρόπα-γαλακτοτρόπα, 5 κορτικοτρόπα και 13 μη λειτουργικά αδενώματα. Τα τελευταία περιελάμβαναν 8 γοναδοτρόπα αδενώματα και 4 αδενώματα null κυττάρων, από τα οποία 4 ογκοκυτταρικά.

Μελέτη της απόπτωσης

Ο χαρακτηριστικός περιοδικός ενδονουκλεοσωματικός κατακερματισμός του DNA των αποπτωτικών κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα ApopTag (Oncor, Gaithersburg, MD, USA), με τη χρήση της τεχνικής in situ σήμανσης των τελικών υδροξυλομάδων του DNA (ISEL). Τομές παραφίνης πάχους 5 μm, αφού αποπαραφινώθηκαν, ενυδατώθηκαν σε αλκοόλες και εκπλύθηκαν με αποσταγμένο νερό, επωάστηκαν με 60 mg/mL διάλυμα πρωτεϊνάσης Κ (Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA, USA) σε θερμοκρασία δωματίου για 15 min. Ακολούθησε εξουδετέρωση της δράσης της ενδογενούς υπεροξειδάσης με διάλυμα 3% Η₂Ο₂ σε σκοτεινό περιβάλλον για 15 min και έκπλυση με PBS. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με το equilibration buffer, αφού καλύφθηκαν με πλαστική καλυπτρίδα, σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι 20 min, και ακολούθως με μίγμα 1:3 ενζύμου τελικής τρανσφεράσης σε reaction buffer στους 37 °C για 1 ώρα. Η αντίδραση τερματίστηκε σε προθερμασμένο διάλυμα αναστολής (stop/wash buffer) στους 37 °C για 30 min. Οι τομές εκπλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με σύμπλεγμα αντι-διγοξιγενίνης-υπεροξειδάσης σε υγρό περιβάλλον για 30 min, αφού καλύφθηκαν με πλαστική καλυπτρίδα. Ακολούθησαν εκπλύσεις με PBS και εφαρμογή διαλύματος 0,06% χρωμογόνου 3,3-διαμινοβενζιδίνης σε PBS και 1 μL/mL H₂O₂, εμπλουτισμένου με 1 mg/mL χλωριούχο νικέλιο (Sigma). Το τελευταίο προσέδωσε μαύρο χρώμα στις θέσεις σύνδεσης με το DNA. Για αντίχρωση χρησιμοποιήθηκε διάλυμα 2% πράσινου του μεθυλίου σε οξικό νάτριο με προσθήκη 10% διαλύματος οξικού οξέος (τελικό pH 4,0) και ακολούθησε έκπλυση, γρήγορη αφυδάτωση σε αλκοόλες, διαύγαση σε ξυλόλη, επίστρωση και επικάλυψη των τομών. Φυσιολογικοί λεμφαδένες και δείγματα βλεννογόνου λεπτού εντέρου χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες, ενώ τομές στις οποίες το διάλυμα της τελικής τρανσφεράσης υποκαταστάθηκε με reaction buffer, χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες.

Μετρήσεις

Η ανοσοϊστοχημική έκφραση των πρωτεϊνών bcl-2 και bax ποσοτικοποιήθηκε με τη χρήση συστήματος Histoscore (HSC), που κυμαινόταν από 0 έως 12 βαθμούς, και υπολογίστηκε από το γινόμενο του βαθμού του ποσοστού θετικών κυττάρων (0–5%=0, 5–25%=1, 26–50%=2, 51–75%=3 και 76–100%= 4) με το βαθμό έντασης της χρώσης (1=ήπια, 2=μέτρια και 3=έντονη ανοσοθετικότητα). Αυτές οι μέθοδοι διαβάθμισης έχουν χρησιμοποιηθεί, με καλά αποτελέσματα, σε μελέτες καρκινωμάτων παχέος εντέρου²⁷ και μη-Hodgkin λεμφωμάτων.²⁸

Για την εκτίμηση του αποπτωτικού δείκτη (ΑΔ) φωτογραφήθηκαν περιοχές κάθε όγκου με τελική μεγέθυνση 400΄ και εξετάστηκαν τουλάχιστον 500 πυρήνες. Θετικοί θεωρήθηκαν μόνο πυρήνες που ήταν έντονα, διάχυτα ή μερικά σημασμένοι με χαρακτηριστική εικόνα απόπτωσης, όπως περιθωριοποίηση της χρωματίνης ή ημισεληνοειδείς σχηματισμοί. Για την αποφυγή υποεκτίμησης λόγω της ετερογένειας και της σπανιότητας των αποπτωτικών κυττάρων, υπολογίστηκε ο ΑΔ μετρώντας θετικούς πυρήνες από καλά σημασμένες περιοχές. Η μέθοδος αυτή έχει ήδη χρησιμοποιηθεί, με ικανοποιητικά αποτελέσματα, στην εκτίμηση και άλλων πυρηνικών δεικτών, όπως η βρωμοδεξυουριδίνη.²⁹ Θα πρέπει ωστόσο να τονιστεί ότι ο ΑΔ δεν αποτελεί ακριβή προσδιορισμό του βαθμού απόπτωσης, αλλά βοηθά στην ευχερή εκτίμηση πιθανών διαφορών ανάμεσα στους διάφορους τύπους των αδενωμάτων. Οι μετρήσεις έγιναν από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές, που αγνοούσαν το μορφολογικό τύπο των όγκων και ο ΑΔ εκφράστηκε ως ο μέσος όρος του ποσοστού των θετικών προς το σύνολο των πυρήνων που μετρήθηκαν.

Στατιστική ανάλυση

Για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε το Student’s t-test και το Pearson product moment-correlation test. Τιμές P μικρότερες του 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές. Επιπλέον, υπολογίστηκε ο συντελεστής συμφωνίας k για τα ζεύγη τιμών ανάμεσα στους δύο παρατηρητές.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Με το οπτικό μικροσκόπιο παρατηρήθηκαν ελάχιστα διάσπαρτα αποπτωτικά κύτταρα, συνήθως λιγότερα του 1% του κυτταρικού πληθυσμού. Τα κύτταρα αυτά εμφάνιζαν ελάττωση του κυτταρικού όγκου με συρρίκνωση και ηωσινοφιλία του κυτταροπλάσματος, πύκνωση και περιθωριοποίηση της χρωματίνης, ως αποτέλεσμα του κατακερματισμού του DNA. Σε προχωρημένα στάδια, λίγα κύτταρα χαρακτηρίζονταν από απώλεια των μεσοκυττάριων συνάψεων με τα προσκείμενα κύτταρα και από σχηματισμό αποπτωτικών σωματίων (εικ. 1). Με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο αναγνωρίστηκαν πρώιμες αποπτωτικές αλλοιώσεις, όπως πύκνωση της πυρηνικής χρωματίνης με ημισεληνοειδείς σχηματισμούς, περιπυρηνική διαύγαση, απώλεια κυτταρικών συνάψεων και αυτολυτικές κυτταροπλασματικές αλλοιώσεις (εικ. 2). Προχωρημένα στάδια χαρακτηρίζονταν από σχηματισμό αποπτωτικών σωματίων και αυξημένη φαγοκυτταρική ικανότητα των παρακείμενων κυττάρων.

Η ανοσοθετικότητα για bcl-2 και bax εντοπιζόταν στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων, τόσο στη φυσιολογική αδενοϋπόφυση, όσο και στα αδενώματα. Επιπλέον, η πρωτεΐνη bcl-2 εμφάνιζε χαρακτηριστική παραπυρηνική ή περιπυρηνική δακτυλιοειδή κατανομή (Golgi pattern) (εικ. 3). Αν και η ανοσοθετικότητα ήταν ομοιογενής, ο βαθμός της έντασης παρουσίαζε διακύμανση (εικ. 4). Η πρωτεΐνη bcl-2 ανιχνεύθηκε σε 58% των όγκων, που αφορούσαν 32 (53,5%) λειτουργικά και 15 (71,5%) μη λειτουργικά αδενώματα. Ειδικότερα, ανοσοθετικότητα για bcl-2 βρέθηκε σε 10 (52,5%) σωματοτρόπα, 10 (62,5%) γαλακτοτρόπα, 5 (50%) μικτά σωματοτρόπα-γαλακτοτρόπα και 7 (46,5%) κορτικοτρόπα αδενώματα. Η πρωτεΐνη bax είχε διάχυτη κυτταροπλασματική κατανομή και σε μερικές περιπτώσεις ήταν ιδιαίτερα έντονη κατά μήκος της κυτταρικής μεμβράνης (εικ. 5). Η πρωτεΐνη bax ανιχνεύθηκε σε 65 (80%) συνολικά όγκους, από τους οποίους 50 (83,5%) ήταν λειτουργικοί και 15 (71,5%) μη λειτουργικοί και, ειδικότερα, σε 13 (68,5%) σωματοτρόπα, 15 (94%) γαλακτοτρόπα, 8 (80%) μικτά σωματοτρόπα-γαλακτοτρόπα και 14 (93,5%) κορτικοτρόπα αδενώματα. Το bcl-2 HSC (πίν. 1) ήταν υψηλότερο στα μη λειτουργικά (4,95) από ό,τι στα λειτουργικά (2,76) αδενώματα σε βαθμό στατιστικώς σημαντικό (P=0,02). Επιμέρους στατιστικώς σημαντικές διαφορές στο bcl-2 HSC βρέθηκαν μεταξύ μη λειτουργικών (4,95) και κορτικοτρόπων (1,2) αδενωμάτων (P=0,002), καθώς και μεταξύ γαλακτοτρόπων (3,56) και κορτικοτρόπων αδενωμάτων (P=0,01). Όσον αφορά το bax HSC (πίν. 1), δεν βρέθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ λειτουργικών (5,91) και μη λειτουργικών (5,58) αδενωμάτων. Η συγκριτική ανάλυση της έκφρασης της bax στους διαφόρους τύπους λειτουργικών αδενωμάτων έδειξε σημαντικώς υψηλότερο bax HSC στα κορτικοτρόπα (6,98) από ό,τι στα σωματοτρόπα (4,40) αδενώματα (P=0,05).

Συνολικά, 45 από τα 81 (55,5%) αδενώματα περιελάμβαναν θετικούς αποπτωτικούς πυρήνες με την τεχνική ISEL, από τα οποία 39 (65%) αφορούσαν λειτουργικούς και 6 (28,5%) μη λειτουργικούς όγκους. Ειδικότερα, για τους λειτουργικούς όγκους, θετικότητα παρατηρήθηκε σε 14 (73,5%) σωματοτρόπα, 11 (69%) γαλακτοτρόπα, 5 (50%) μικτά σωματοτρόπα-γαλακτοτρόπα και 9 (60%) κορτικοτρόπα αδενώματα. Όλοι οι τύποι αδενωμάτων περιελάμβαναν κυμαινόμενο αριθμό αποπτωτικών κυττάρων με εστιακή ή διάσπαρτη κατανομή (εικ. 6). Ο συντελεστής συμφωνίας k στην εκτίμηση του ΑΔ μεταξύ των δύο ανεξάρτητων παρατηρητών ήταν 0,87. Ένα ευρύ φάσμα ΑΔ παρατηρήθηκε στους περισσότερους τύπους αδενωμάτων (πίν. 1). Τα λειτουργικά αδενώματα είχαν υψηλότερο ΑΔ (5,7%) από ό,τι οι μη λειτουργικοί όγκοι (1,92%) και αυτή η διαφορά ήταν στατιστικώς σημαντική (P=0,03). Το υψηλότερο ποσοστό θετικών πυρήνων παρατηρήθηκε στα κορτικοτρόπα αδενώματα (6,81%), ακολουθούμενα από τα γαλακτοτρόπα (5,57%), σωματοτρόπα (5,51%) και μικτά σωματοτρόπα-γαλακτοτρόπα (4,59%) αδενώματα. Ο ΑΔ κάθε τύπου λειτουργικού αδενώματος διέφερε σημαντικά από τον ΑΔ των μη λειτουργικών όγκων και παρουσίαζε στατιστικώς σημαντική διαφορά με τα κορτικοτρόπα αδενώματα (P=0,02). Αναφορικά με το μέγεθος του όγκου, υψηλότερος ΑΔ παρατηρήθηκε στα μικροαδενώματα (8,7%) από ό,τι στα μακροαδενώματα (5,58%) της ομάδας των λειτουργικών όγκων, αλλά οι διαφορές αυτές δεν ήταν στατιστικώς σημαντικές. Σύγκριση μεταξύ αδενωμάτων που παρήγαγαν GH ή και PRL σε ασθενείς με ή χωρίς προεγχειρητική φαρμακευτική θεραπεία δεν έδειξε επίσης σημαντικές διαφορές, αν και παρατηρήθηκε υψηλότερος ΑΔ στα αδενώματα ασθενών χωρίς θεραπεία και, ειδικότερα, στα γαλακτοτρόπα (πίν. 2). Τέλος, δεν παρατηρήθηκαν αποπτωτικά κύτταρα στις μη νεοπλασματικές νεκροτομικές υποφύσεις και στα μη νεο πλασματικά ιστοτμημάτια που περιλαμβάνονταν στο υλικό των αδενωμάτων.

Παρατηρήθηκε αντίστροφη σχέση του ΑΔ με την έκφραση της πρωτεΐνης bcl-2 σε όλους τους τύπους αδενωμάτων, εκτός από τα γαλακτοτρόπα αδενώματα, και μάλιστα σε στατιστικώς σημαντικό βαθμό στα κορτικοτρόπα αδενώματα (Pearson product moment correlation, r=-0,59 και P=0,02). Αντίθετα, ο βαθμός της απόπτωσης δεν έδειξε να σχετίζεται με την έκφραση της πρωτεΐνης bax.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Στη διεθνή βιβλιογραφία αναφέρεται περιορισμένος αριθμός μελετών που ερευνούν την απόπτωση στην υπόφυση και βασίζονται κυρίως σε σειρές αδενοϋποφυσιακών κυττάρων^30–37 και υποφύσεις τρωκτικών.^38–41 Αναφορικά με τα υποφυσιακά αδενώματα στον άνθρωπο, η ρύθμιση και η σημασία της απόπτωσης παραμένει ως επί το πλείστον άγνωστη.^42,43 In vivo μορφολογικές μελέτες σε ποντίκια με υπερπλασία γαλακτοτρόπων κυττάρων προκληθείσα μετά από χορήγηση οιστρογόνων, έδειξαν αύξηση της απόπτωσης μετά την απόσυρση των οιστρογόνων.³⁸ Ακόλουθη χορήγηση βρωμοκρυπτίνης προκάλεσε το διπλασιασμό του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα που δεν έλαβε φαρμακευτική αγωγή. Οι συγγραφείς υπέθεσαν ότι οι αγωνιστές των υποδοχέων ντοπαμίνης μπορεί να επάγουν την απόπτωση και να επηρεάζουν τις φαγοκυτταρικές ικανότητες των αστεροειδών κυττάρων της αδενοϋπόφυσης. Σε μια άλλη μελέτη, χρησιμοποιώντας την τεχνική ISEL, βρέθηκε ότι η βρωμοκρυπτίνη προάγει την απόπτωση στα σωματοτρόπα κύτταρα αδενώματος (GH1) του αρουραίου³⁰ και στα κορτικοτρόπα κύτταρα αδενώματος (AtT-20) του ποντικού.³¹ Οι Yonezawa et al⁴⁰ βρήκαν ότι η βρωμοκρυπτίνη και η τεργκουρίδη (terguride) μπορούν να καταστείλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και να επάγουν την απόπτωση στην αδενοϋπόφυση του θηλυκού Wistar αρουραίου, μετά από οιστρογονική διέγερση. Έχει αποδειχθεί επίσης ότι το ανάλογο της σωματοστατίνης SMS 201–995 αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με την επαγωγή της απόπτωσης, στα AtT-20 υποφυσιακά κύτταρα που συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται, εκτός αυτών που σταματούν στην G1 ή G2 φάση του κύκλου.³² Έχει προταθεί ότι η αύξηση του c-myc, που προκαλεί η σωματοστατίνη, σχετιζόμενη με απενεργοποίηση των υποδοχέων των κινασών των αυξητικών παραγόντων, μπορεί να παίζει κάποιο ρόλο στην επαγωγή της απόπτωσης.³³ Επιπλέον, διάφοροι άλλοι παράγοντες μπορούν να δρουν αποπτωτικά σε κυτταρικές σειρές υποφυσιακών αδενωμάτων, όπως ο αναστολέας της πρωτεϊνικής κινάσης C υπερισίνη (hypericin) στα AtT-20 και GH₄C₁ κύτταρα,³⁴ καθώς και οι αναστολείς των φωσφατασών σερίνης/θρεονίνης οκαδαϊκό οξύ (okadaic acid) και καλικουλίνη Α (calyculin A) στα GH3 κύτταρα.^36,37 Τέλος, οι Guo et al,³⁹ σε μελέτη της βλαπτικής επίδρασης της ακτινοβολίας σε υπόφυση αρουραίου, διαπίστωσαν αυξημένη απόπτωση μετά από ορμονική και φαρμακευτική απόσυρση, παρατήρηση που υποδηλώνει ότι η αποτελεσματικότητα των παραγόντων που επάγουν την ελάττωση του μεγέθους του όγκου in vivo μπορεί να οφείλεται σε ταχεία κυτταρική απόπτωση.

Οι Green et al,⁴² με την τεχνική ISEL, διαπίστωσαν απόπτωση στα αδενώματα υπόφυσης του ανθρώπου συχνότερα σε μη λειτουργικούς όγκους, αλλά χωρίς στατιστικώς σημαντικές διαφορές από τους λειτουργικούς. Στη μελέτη αυτή δεν διαπιστώθηκε σχέση της απόπτωσης με την έκφραση της πρωτεΐνης p53, καθώς και με το μέγεθος ή τον τύπο του αδενώματος.

Τα αποτελέσματα της παρούσας, όσο και προηγούμενης μελέτης μας,⁴³ σχετικά με το φαινόμενο της απόπτωσης στα αδενώματα υπόφυσης του ανθρώπου, δείχνουν ότι η απόπτωση απαντά κυρίως στα λειτουργικά αδενώματα, με στατιστικώς σημαντική διαφορά από τα μη λειτουργικά. Είναι γνωστό ότι ιδιαίτερα τα μη λειτουργικά αδενώματα αυξάνουν βραδέως, λόγω χαμηλού βαθμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού.^44–46 Οι παρατηρήσεις αυτές συμφωνούν με το στατιστικώς σημαντικά υψηλότερο ΑΔ που παρατηρήθηκε στα λειτουργικά αδενώματα και υποδηλώνουν ότι ο ρυθμός της απόπτωσης εξαρτάται και από το ρυθμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

Ο υψηλότερος αποπτωτικός δείκτης που παρατηρήθηκε στα κορτικοτρόπα αδενώματα θα μπορούσε μερικώς να αποδοθεί στην άμεση επίδραση των γλυκοκορτικοειδών που υπερπαράγονται λόγω υπερέκκρισης ACTH. Αν η υπόθεση αυτή είναι αληθής, ερμηνεύει το κατά κανόνα μικρό μέγεθος των κορτικοτρόπων αδενωμάτων^45–47 ως αποτέλεσμα αυξημένης αποπτωτικής δραστηριότητας. Μεταξύ μικροαδενωμάτων και μακροαδενωμάτων δεν βρέθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά, αν και παρατηρήθηκε υψηλότερος ΑΔ στα πρώτα. Τέλος, υψηλότερος ΑΔ παρατηρήθηκε σε αδενώματα ασθενών που δεν είχαν λάβει προεγχειρητική θεραπεία και ειδικότερα στα γαλακτοτρόπα, χωρίς όμως στατιστικώς σημαντικές διαφορές με την ομάδα ασθενών που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία. Οι διαφορές αυτές μπορεί να αποδοθούν στην παρουσία κυτταρικού υποπληθυσμού, που είναι πιο ευαίσθητος στην απόπτωση και απαντά ταχέως στο ερέθισμα της φαρμακευτικής αγωγής. Πιθανώς, το μεγαλύτερο μέρος του κυτταρικού αυτού πληθυσμού απαλείφεται κατά το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί από την έναρξη της θεραπείας μέχρι την εξαίρεση του όγκου και δεν ανιχνεύεται πλέον στον ιστό.

Οι μελέτες που αφορούν την έκφραση της πρωτεΐνης bcl-2 στα αδενώματα υπόφυσης είναι ελάχιστες και κυρίως πειραματικές. Ανοσοϊστοχημικά, βρέθηκε ότι η ογκοπρωτεΐνη bcl-2 εκφράζεται στο 30% των υποφυσιακών αδενωμάτων.⁴⁸ Στην παρούσα μελέτη, η συχνότητα έκφρασης της bcl-2 ήταν 58%. Οι διαφορές αυτές πιθανώς αποδίδονται στα διαφορετικά πρωτόκολλα επανάκτησης της αντιγονικότητας, που χρησιμοποιήθηκαν. Οι Woloschak et al,³⁵ μελετώντας τα αποτελέσματα της βλάβης του DNA μετά από επίδραση γ-ακτινοβολίας σε σειρά υποφυσιακών κυττάρων ποντικού (AtT-20), έδωσαν προσοχή στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, στην επαγωγή της απόπτωσης και στην έκφραση γνωστών ρυθμιστικών παραγόντων των φαινομένων αυτών, όπως η p53, το c-myc και η bcl-2. Παρατήρησαν αναστολή του πολλαπλασιασμού των ΑtT-20 κυττάρων στις G1 και G2 φάσεις του κύκλου και ότι σημαντικό ποσοστό αυτών οδηγούνταν σε απόπτωση. Η παραμονή στην G1 φάση συμβάδιζε με έντονη έκφραση της πρωτεΐνης p53, ενώ η έκφραση του c-myc ελαττωνόταν προοδευτικά. Η απόπτωση ήταν ανεξάρτητη από την έκφραση του γονιδίου bcl-2 στα κύτταρα αυτά, πιθανώς λόγω της υψηλής βασικής τιμής έκφρασης της bcl-2 στην κυτταρική σειρά. Τέλος, οι Ahlbom et al,⁴¹ μελετώντας τους μηχανισμούς που υπεισέρχονται στην επαναφορά της φυσιολογικής λειτουργίας του προσθίου λοβού της υπόφυσης του αρουραίου μετά τον απογαλακτισμό, παρατήρησαν ότι το φαινόμενο αυτό εξελίσσεται μέσω αποπτωτικής διαδικασίας και συνοδεύεται από αύξηση των πρωτεϊνών p53 και bax και ελάττωση της πρωτεΐνης bcl-2.

Στην παρούσα μελέτη, οι πρωτεΐνες bcl-2 και bax έδειξαν παρόμοια κατανομή και ένταση ανοσοχρώσης στους μάρτυρες της μη νεοπλασματικής αδενοϋπόφυσης. Αντίθετα, στα αδενώματα η συχνότητα της bcl-2 ήταν χαμηλότερη σε σύγκριση με αυτή της bax. Το HSC της πρωτεΐνης bcl-2 στα μη λειτουργικά αδενώματα ήταν στατιστικώς σημαντικά υψηλότερο από αυτό των λειτουργικών και παρουσίαζε αντίστροφη σχέση με τον ΑΔ. Με εξαίρεση τα γαλακτοτρόπα αδενώματα, παρόμοια αντίστροφη σχέση βρέθηκε σε κάθε επιμέρους τύπο αδενώματος και ιδιαίτερα στα κορτικοτρόπα, όπου οι διαφορές ήταν στατιστικώς σημαντικές. Όσον αφορά την έκφραση της πρωτεΐνης bax, δεν βρέθηκαν διαφορές μεταξύ των διαφόρων τύπων αδενωμάτων και δεν υπήρχε συσχέτιση του HSC της bax και του ΑΔ.

Συμπερασματικά, η απόπτωση είναι συχνότερη σε λειτουργικά αδενώματα. Αντίθετα, η έκφραση της bcl-2 είναι υψηλότερη σε μη λειτουργικά αδενώματα, ενώ η bax εκφράζεται με παρόμοια συχνότητα σε όλους τους τύπους των αδενωμάτων. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το δίπολο των μορίων bcl-2/bax φαίνεται να εμπλέκεται στη ρύθμιση της απόπτωσης στα αδενώματα της υπόφυσης του ανθρώπου. Επομένως, η μελέτη της απόπτωσης μπορεί να συμβάλει σημαντικά στην κατανόηση της βιολογίας και των ρυθμιστικών μηχανισμών που υπεισέρχονται στην εξέλιξη της νεοπλασματικής εξεργασίας και της λειτουργικότητας των υποφυσιακών αδενωμάτων.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Οι συγγραφείς εκφράζουν τις ιδιαίτερες ευχαριστίες τους στην τεχνολόγο κα Μάγδα Πατεράκη για την πολύτιμη συμβολή της στις μορφολογικές μελέτες.

Πηγές χρηματοδότησης:
– Ερευνητικό Πρόγραμμα ΚΕΣΥ Ε-52/96 και Ε-53/96
– Εθνικό Πρόγραμμα Ορμονών και Υπόφυσης (ΝHPP) των Διεθνών Ινστιτούτων Υγείας (ΝΙΗ), Bethesda, MD, USA

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. KERR JF. Shrinkage necrosis: a distinct mode of cellular death. J Pathol 1971, 105:13–20
2. KERR JFR, WYLLIE AH, CURRIE AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972, 26:239–257
3. ARENDS MJ, MORRIS RG, WYLLIE AH. Apoptosis. The role of the endonuclease. Am J Pathol 1990, 136:593–608
4. BRUSCH W, KLEIN L, TENNISWOOD M. The biochemistry of cell death by apoptosis. Biochem Cell Biol 1990, 88:1071–1074
5. KERR JFR, HARMON BV. Definition and incidence of apoptosis: A historical perspective. In: Tomei LD, Cope FO (eds) Apoptosis: The Molecular Basis of Cell Death. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1991:5–29
6. TSUJIMOTO Y, GORHAM J, COSSMAN J, JAFFE E, CROCE CM. The t(14;18) chromosome translocation involved in B cell neoplasms result from mistakes in VDJ joining. Science 1985, 229:1390– 1393
7. HOCKENBERRY D, NUNEZ G, MILLIMAN C, SCHREIBER RD, KORSMEYER SJ. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. Nature (London) 1990, 348:334–336
8. KORSMEYER SJ. Bcl-2: An antidote of programmed cell death. Cancer Surv 1992, 15:105–118
9. YANG J, LIU X, BHALLA K, KIM CN, IBRADO AM, CAI J ET AL. Prevention of apoptosis by bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science 1997, 275:1129–1132
10. KLUCK RM, BOSSY-WETZEL E, GREEN DR, NEWMEYER DD. The release of cytochrome c from mitochondria: A primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. Science 1997, 275:1132–1136
11. LIU X, KIM CN, YANG J, JEMMERSON R, WANG X. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell 1996, 86:147–157
12. REED JC, ZHA H, AIME-SEMPE C, TAKAYAMA S, WANG HG. Structure-function analysis of Bcl-2 family proteins. Regulators of programmed cell death. Adv Exp Med Biol 1996, 406:99–112
13. FARROW SN, BROWN R. New members of the Bcl-2 family and their protein partners. Curr Opin Genet Dev 1996, 6:45–49
14. OLTVAI ZN, MILLMAN CL, KORSMEYER SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell 1993, 74:609–619
15. KORSMEYER SJ, SHUTTER JR, VEIS DJ, MERRY DE, OLTVAI DE. Bcl-2/Bax: a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death. Semin Cancer Biol 1993, 4:327–332
16. KORSMEYER SJ. Regulators of cell death. Trends Genet 1995, 11: 101–105
17. BARGOU RC, DANIEL PT, MAPARA MY, BOMMERT K, WAGENER C, KALLINICH B ET AL. Expression of the bcl-2 gene family in normal and malignant breast tissue: Low bax-α expression in tumor cells correlates with resistance towards apoptosis. Int J Cancer 1995, 60:854–859
18. KNUDSON CM, TUNG K, BROWN G, KORSMEYER SJ. Bax de ficient mice demonstrate lymphoid hyperplasia but male germ cell death. Science 1995, 270:96–99
19. YIN C, KNUDSON CM, KORSMEYER SJ, VAN DYKE T. Bax suppresses tumorigenesis and stimulates apoptosis. Nature 1997, 385:637– 640
20. RAMBINO N, YAMAMOTO H, IONOV Y, LI Y, SAWAI H, REED JC ET AL. Somatic frameshift mutations in the bax gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype. Science 1997, 275:967– 969
21. REED JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol 1994, 124:1–6
22. YIN XM, OLTVAI ZN, KORSMEYER SJ. BH1 and BH2 domains of Bcl-2 are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with bax. Nature 1994, 369:321–323
23. WHITE E. Life, death, and the pursuit of apoptosis. Genes Dev 1996, 10:1–15
24. SCHMITZ GG, WALTER T, SEIBL R, KESSLER C. Nonradioactive labeling of oligonucleotides in vitro with hapten digoxigenin by tailing with terminal transferase. Anal Biochem 1991, 192:222–231
25. WIJSMAN JH, JONKER RR, KEIZER R, VAN DE VELDE CJH, CORNELISSE CJ, VAN DIERENDONCK JH. A new method to detect apoptosis in paraffin sections: in situ end-labeling of fragmented DNA. J Histochem Cytochem 1993, 41:7–12
26. KONTOGEORGOS G, KOVACS K, SCHEITHAUER WB, ROLOGIS D, ORPHANIDIS G. α-subunit immunoreactivity in plurihormonal adenomas of patients with acromegaly. Mod Pathol 1991, 4:191– 195
27. SINICROPE FA, RUAN SB, CLEARY KR, STEPHENS LC, LEE JJ, LEVIN B. Bcl-2 and p53 oncoprotein expression during colorectal tumorigenesis. Cancer Res 1995, 55:237–241
28. WHEATON S, NETSER J, GUINEE D, RAHN M, PERKINS S. Bcl-2 and Bax protein expression in indolent versus aggressive B-cell non-Hodgkin lymphomas. Hum Pathol 1998, 29:820–825
29. NEMOTO R, UCHIDA K, HATTORI K, SHIMAZUI T, NISHIJIMA Y, SAITO S ET AL. S-phase fraction of human tumor measured in situ with bromodexyuridine labeling. J Urol 1988, 139:286–289
30. YIN D, KONDO S, TAKEUCHI J, MORIMUTA T. Induction of apoptosis in rat somatotropin-secreting adenoma cells by bromocriptine. Oncol Res 1993, 5:383–387
31. YIN D, KONDO S, TAKEUCHI J, MORIMUTA T. Induction of apoptosis in rat ACTH-secreting adenoma cells by bromocriptine. FEBS Lett 1993, 339:73–75
32. SRIKANT K. Cell cycle-dependent induction of apoptosis by somatostatin analog SMS 201–995 in AtT-20 mouse pituitary cells. Biochem Biophys Res Commun 1995, 209:400–406
33. SHARMA K, SRIKANT CB. Somatostatin analogs induce c-myc gene expression in AtT-20 mouse pituitary tumor cells. 77th Annual Meeting of Endocrine Society, Washington DC, 1995:276 (Book of Abstracts)
34. HAMILTON HB, HINTON DR, LAW RE, GOPALAKRISHNA R, SU YZ, CHEN ZH ET AL. Inhibition of cellular growth and induction of apoptosis in pituitary adenoma cell lines by the protein kinase C inhibitor hypericin: potential therapeutic application. J Neurosurg 1996, 85:329–334
35. WOLOSCHAK M, YU A, XIAO J. Molecular and cellular responses to DNA damage in a murine pituitary adenoma cell line. Mol Cell Endocrinol 1996, 119:61–68
36. RITZ V, MARWITZ J, RICHTER E, ZIEMANN C, QUENTIN I, STEINFELDER HJ. Characterization of two pituitary GH3 cell sublines partially resistant to apoptosis induction by okadaic acid. Biochem Pharmacol 1997, 54:967–971
37. TERGAU F, WEICHERT J, QUENTIN I, OPITZ R, VON ZEZSCHWITZ C, MARWITZ J ET AL. Inhibitors of ser/thr phosphatases 1 and 2A induce apoptosis in pituitary GH3 cells. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1997, 356:8–16
38. DREWETT N, JACOBI JM, WILLGOSS DA, LLOYD HM. Apoptosis in the anterior pituitary gland of the rat: studies with estrogen and bromocriptine. Neuroendocrinology 1993, 57:89–95
39. GUO YP, HENDRY JH, MORRIS ID, DAVIS JR, BEARDWELL CG. Cell proliferation and death in the irradiated pituitary gland and its modification by growth stimulants. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1997, 38:175–181
40. YONEZAWA K, TAMAKI N, KOKUNAI T. Effects of bromocriptine and terguride on cell proliferation and apoptosis in the estrogen-stimulated anterior pituitary gland of the rat. Neurol Med Chir (Tokyo) 1997, 37:901–906
41. AHLBORN E, GRANDISON L, ZHIVOTOVSKY B, CECCATELLI S. Termination of lactation induces apoptosis and alters the expression of the Bcl-2 family members in the rat anterior pituitary. Endocrinology 1998, 139:2465–2471
42. GREEN VL, WHITE MC, HIPKIN LJ, JEFFREYS RV, FOY PM, ATKIN SL. Apoptosis and p53 suppressor gene protein expression in human pituitary adenomas. Eur J Endocrinol 1997, 136:382–387
43. KONTOGEORGOS G, SAMBAZIOTIS D, PIADITIS G, KARAMERIS A. Apoptosis in human pituitary adenomas: A morphologic and in situ end-labeling study. Mod Pathol 1997, 10:921–926
44. IKEDA H, YOSHIMOTO T. The relation between c-myc protein expression, the bromodeoxyuridine labeling and the biological behavior of pituitary adenomas. Acta Neuropathol (Berl) 1992, 83: 361–364
45. KOVACS K, HORVATH E. Tumors of the pituitary. In: Atlas of Tumor Pathology. Fascicle 21, 2nd series. Washington DC, Armed Forces Institute of Pathology, 1986
46. KONTOGEORGOS G. Pituitary tumours. In: Polak JM (ed) Diagnostic Histopathology of Endocrine Tumours. Churchill Living stone, London, 1993:227–269
47. SAEGER W. Morphology of ACTH-producing pituitary adenomas. In: Fahlbusch R, von Wender K (eds) Treatment of Pituitary Adenomas. Thieme, Stuttgart, 1978:122–130
48. WANG DG, JOHNSTON CF, ATKINSON AB, HEANEY AP, MIRAKHUR M, BUCHANAN KD. Expression of bcl-2 oncoprotein in pituitary tumours: comparison with c-myc. J Clin Pathol 1996, 49:795–797