Τελ. ενημέρωση:
   15-Jun-2001
 

Αρχ Ελλ Ιατρ, 17(6), Νοέμβριος-Δεκέμβριος 2000, 584-592

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Ανοσοεντόπιση της κυτοκερατίνης 8
σε πορογενή διηθητικά καρκινώματα του μαστού
σε ημίλεπτες τομές εποξικών ρητινών

Σ. ΧΑΒΑΚΗ,1 Ε. ΜΠΑΛΤΑΤΖΗ-ΒΟΛΟΥΔΑΚΗ,2 Ο. ΔΑΦΝΗ,3 Ν. ΓΟΥΤΑΣ,1
Δ.Λ. ΑΡΒΑΝΙΤΗΣ,4 Χρ. ΚΙΤΤΑΣ,1 Ε. ΜΑΡΙΝΟΣ1
1Eργαστήριο Ιστολογίας και Εμβρυολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Αθηνών
2Τμήμα Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας- Κυτταρικής Βιολογίας, Ερευνητικό Κέντρο Ογκολογίας «Γ. Παπανικολάου», Αντικαρκινικό Νοσοκομείο «Άγιος Σάββας»
3Τομέας Δημόσιας Υγείας, Τμήμα Νοσηλευτικής, Πανεπιστήμιο Αθηνών
4Τμήμα Ανατομίας-Ιστολογίας-Εμβρυολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας

ΣΚΟΠΟΣ Οι κυτοκερατίνες ανήκουν στα ενδιάμεσα ινίδια του κυτταροσκελετού των επιθηλιακών κυττάρων. Ο συνδυασμός των κυτοκερατινών που εκφράζονται σε ένα επιθήλιο είναι ειδικός για το συγκεκριμένο είδος επιθηλίου. Η κυτοκερατίνη 8 (Κ8) εκφράζεται κυρίως στα απλά επιθήλια, όπως στα κύτταρα του πόρου του μαζικού αδένα, καθώς και στα αντίστοιχα νεοπλάσματα. Η Κ8 φαίνεται να εμπλέκεται στην ενίσχυση της επιθετικότητας των καρκινικών κυττάρων μαστού in vitro. Έχει εντοπιστεί, σε καλλιέργεια, στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, καθώς και στο καλλιεργητικό μέσο. Με βάση το γεγονός ότι η ακριβής κατανομή και λειτουργία της Κ8 in vivo δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανοσοϊστοχημική μελέτη, σε επίπεδο οπτικού μικροσκοπίου, της κατανομής της Κ8 σε ημίλεπτες τομές εποξικών ρητινών πορογενών διηθητικών καρκινωμάτων μαστού, με την προοπτική της λεπτομερούς μελέτης της σε επίπεδο ηλεκτρονικού μικροσκοπίου (ΗΜ). Επίσης, εξετάστηκε ο ρόλος της Κ8 ως προγνωστικού παράγοντα στα πορογενή διηθητικά καρκινώματα μαστού.
ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΣ Μελετήθηκαν 9 περιπτώσεις διηθητικών πορογενών καρκινωμάτων μαστού και 4 περιπτώσεις ινοαδενωμάτων. Από κάθε περίπτωση, μικρά τεμάχια φρέσκου ιστού μονιμοποιήθηκαν, αφυδατώθηκαν και εγκλείστηκαν σε μίγμα εποξικών ρητινών. Μετά τη διάβρωση του πολυμερούς των εποξικών ρητινών από ημίλεπτες τομές επιλεγμένων καρκινικών περιοχών, εφαρμόστηκε η έμμεση ανοσοϊστοχημική μέθοδος δύο βημάτων της ανοσοϋπεροξειδάσης για την εντόπιση της Κ8. Ακολούθησε ψηφιακή ανάλυση εικόνων των καρκινικών κυττάρων για τη μέτρηση της μέσης οπτικής πυκνότητας του κυτταροπλάσματός τους, που αντιπροσωπεύει το βαθμό έκφρασης της Κ8. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σε όλες τις περιπτώσεις των πορογενών διηθητικών καρκινωμάτων μαστού παρατηρήθηκε διαβάθμιση της αντίδρασης ως προς την Κ8 στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων. Στα καλοήθη νεοπλάσματα η αντίδραση ήταν πιο έντονη και ομοιογενής, ενώ στους αρνητικούς μάρτυρες δεν παρατηρήθηκε αντίδραση. Η στατιστική επεξεργασία των μετρήσεων της μέσης κυτταροπλασματικής οπτικής πυκνότητας των καρκινικών κυττάρων έδειξε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των βαθμών κακοήθειας ΙΙ, ΙΙΙ και των ινοαδενωμάτων, ενώ δεν ήταν στατιστικώς σημαντικές οι διαφορές μεταξύ των διαφόρων βαθμών κακοήθειας.
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ο τρόπος επεξεργασίας του υπό μελέτη υλικού εξασφάλισε την επιτυχή και ειδική ανοσοεντόπιση της Κ8 σε ημίλεπτες τομές πορογενών διηθητικών καρκινωμάτων μαστού. Έτσι, δίνεται η δυνατότητα το ίδιο ακριβώς υλικό να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω μελέτη της υπερμικροσκοπικής κατανομής της Κ8 στο ΗΜ. Τα στατιστικά αποτελέσματα έδειξαν ότι ο βαθμός έκφρασης της Κ8 δεν αποτελεί ασφαλή δείκτη για την εκτίμηση του βαθμού κακοήθειας, αντίθετα όμως αποτελεί ασφαλή δείκτη διάκρισης μεταξύ κακοήθειας και καλοήθειας.

Λέξεις ευρετηρίου: Aνοσοϊστοχημεία, Kυτοκερατίνη 8, Μαστός, Μορφομετρία, Πορογενές διηθητικό καρκίνωμα.

Οι κυτοκερατίνες υπάγονται στα ενδιάμεσα ινίδια του κυτταροσκελετού. Αποτελούν ομάδα 20 διαφορετικών πεπτιδίων,1–4 που συνδυάζονται ανά δύο για να συνθέσουν ετεροδιμερή. Οι κυτοκερατίνες βρίσκονται σε διάφορα είδη ιστών και είναι άφθονες στα επιθήλια. Ο συνδυασμός των κυτοκερατινών που εκφράζονται σ' ένα επιθήλιο είναι ειδικός για τον τύπο του συγκεκριμένου επιθηλίου και εξαρτάται από το βαθμό διαφοροποίησης των κυττάρων.1,5–7 Είναι χαρακτηριστικό ότι, όταν φυσιολογικά κύτταρα ενός επιθηλίου υφίστανται εξαλλαγή, συνεχίζουν να εκφράζουν συνήθως τον ίδιο συνδυασμό κυτοκερατινών όπως και τα αντίστοιχα φυσιολογικά, από τα οποία έχουν προέλθει.8,9 Η διαπίστωση αυτή έχει προσφέρει μεγάλη βοήθεια στη διαφορική διάγνωση και στο διαχωρισμό κατά κατηγορίες των επιθηλιακών όγκων,10 με την εφαρμογή μεθόδων ανοσοϊστοχημικού εντοπισμού των κυτοκερατινών σε μεγάλη ποικιλία ιστών. Ο ακριβής λειτουργικός ρόλος των κυτοκερατινών παραμένει ακόμη άγνωστος11,12 και η πιθανή ικανότητά τους να αλλάζουν το δυναμικό της καρκινογένεσης απαιτεί περαιτέρω μελέτη.13

Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η κυτοκερατίνη 8 (Κ8), η οποία εκφράζεται κυρίως στα απλά επιθήλια, όπως σε αυτό του πόρου του μαζικού αδένα, στο επιθήλιο της τραχείας, της ουροδόχου κύστης και στα ηπατοκύτταρα.3 Η Κ8 συνθέτει ετεροπολυμερές με την κυτοκερατίνη 18 (Κ18) ή την κυτοκερατίνη 19 (Κ19), για να διαμορφωθεί το ενδιάμεσο ινίδιο του κυτταροσκελετού. Η Κ8, μαζί με τις Κ18 και Κ19, είναι από τις πρώτες κυτοκερατίνες που εκφράζονται κατά τη φυλογονία κάτω από φυσιολογικές συνθήκες,14 ενώ συνήθως εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό και στα επιθηλιακά νεοπλάσματα.3 Ο βαθμός έκφρασης της Κ8 ποικίλλει ανάλογα με το βαθμό διαφοροποίησης των αδενοκαρκινωμάτων, με τους πιο καλά διαφοροποιημένους όγκους να εμφανίζουν πιο διάχυτη έκφραση της Κ8.15

H K8, σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες, εμπλέκεται στη ρύθμιση της επιθετικότητας των καρκινικών κυττάρων μαστού in vitro, δρώντας ως υποδοχέας του πλασμινογόνου.16–19 Επιπλέον, η Κ8 έχει εντοπιστεί, σε υπερμικροσκοπικό επίπεδο, στην επιφάνεια καρκινικών κυττάρων της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς μαστού MCF-7 μέσα σε κυστικούς σχηματισμούς της κυτταρικής μεμβράνης.20 Απ' αυτούς τους κυστικούς σχηματισμούς είναι δυνατό να προέρχεται η Κ8 που εντοπίζεται στο καλλιεργητικό υλικό της ίδιας σειράς. H εξωκυττάρια εντόπιση της Κ8 και in vivo έχει μεγάλη κλινική σημασία, γιατί η διάχυσή της στον εξωκυττάριο χώρο και η δίοδός της στην κυκλοφορία του αίματος θα μπορούσε να αποτελέσει καρκινικό δείκτη.21

Με βάση τα παραπάνω και το γεγονός ότι η ακριβής κατανομή και λειτουργία της Κ8 in vivo δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανοσοϊστοχημική μελέτη της κατανομής της Κ8, σε επίπεδο οπτικού μικροσκοπίου, σε πορογενή διηθητικά καρκινώματα μαστού, εγκλεισμένα σε μίγμα εποξικών ρητινών. Εφαρμόστηκε η έμμεση ανοσοϊστοχημική μέθοδος δύο βημάτων της υπεροξειδάσης σε ημίλεπτες τομές υλικού βιοψίας από πορογενή διηθητικά καρκινώματα μαστού. Στη συνέχεια, έγινε μορφομετρική μελέτη των καρκινικών κυττάρων στο οπτικό μικροσκόπιο με σύστημα ψηφιακής ανάλυσης εικόνας, σύμφωνα με τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα.22–25 Τα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν στατιστικά, για να εξεταστεί η συσχέτιση του βαθμού έκφρασης της Κ8 με το βαθμό κακοήθειας του υπό μελέτη υλικού, με απώτερο σκοπό να γίνει εφικτή η εκτίμηση του ρόλου της Κ8 ως προγνωστικού παράγοντα στα πορογενή διηθητικά καρκινώματα μαστού.

ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ

Μελετήθηκε υλικό βιοψίας από 9 πορογενή διηθητικά καρκινώματα μαστού και 4 ινοαδενώματα, μετά από χειρουργική αφαίρεσή τους από γυναίκες. Ο αριθμός των περιπτώσεων κρίθηκε ως επαρκής με την εφαρμογή κατάλληλων (στατιστικών) κριτηρίων ελέγχου. Ο βαθμός κακοήθειας των νεοπλασμάτων καθορίστηκε σύμφωνα με το σύστημα βαθμοποίησης Bloom-Richardson (Nottingham modification). Aπό τις 9 περιπτώσεις πορογενών διηθητικών καρκινωμάτων μαστού, 3 ήταν grade I, 3 grade II και 3 grade III. Το υλικό προσφέρθηκε από το Ιατρικό Κέντρο Διάγνωσης και Παρακολούθησης «Πρόληψις».

Επεξεργασία του ιστού

Από κάθε περίπτωση, μικρό τμήμα νωπού ιστού (5–10 mm3) εμβαπτιζόταν σε μονιμοποιητικό διάλυμα γλουταραλδεΰδης 2,5% σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) 0,01 Μ, pH 7,4, για 1 ώρα στους 4 °C. Στη συνέχεια, κοβόταν σε μικρότερα ιστοτεμάχια (1–1,5 mm3). Σ’ αυτό το στάδιο, υπήρχε δυνατότητα παραμονής των ιστοτεμαχίων στο PBS στους 4 °C μέχρι 3 μέρες. Ακολουθούσε δεύτερη μονιμοποίηση των ιστοτεμαχίων σε υδατικό διάλυμα τετροξειδίου του οσμίου 1% για 1 ώρα στους 4 °C και έκπλυσή τους με PBS (3x10 min) στους 4 °C. Στη συνέχεια, γινόταν σταδιακή αφυδάτωση των ιστοτεμαχίων, σε θερμοκρασία δωματίου, με εμβάπτισή τους σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις υδατικών διαλυμάτων αιθυλικής αλκοόλης 30%, 50%, 70%, 90%, για 10 min στο κάθε διάλυμα, και τελικά σε απόλυτη αιθυλική αλκοόλη (3x10 min). Σε θερμοκρασία δωματίου, ακολουθούσε, αρχικά, εμπότιση των ιστοτεμαχίων με οξείδιο του προπυλενίου (3x5 min) και κατόπιν σταδιακή εμπότισή τους από μίγμα εποξικών ρητινών (Epon-Araldite)/οξειδίου του προπυλενίου σε διαλύματα αυξανόμενης συγκέντρωσης, σε αναλογίες: (α) 1:2 για 15 min, (β) 1:1 για 30 min, (γ) 2:1 για 60 min, και τελικά σε καθαρό μίγμα ρητινών (3x15 min). Στη συνέχεια, γινόταν σκήνωση των ιστοτεμαχίων σε ειδικά επίπεδα ελαστικά εκμαγεία και πολυμερισμός των εποξικών ρητινών σε κλίβανο στους 60 °C για 24 ώρες.26 Από κάψουλες, που είχαν επιλεγεί τυχαία, κόβονταν αρχικά σε υπερμικροτόμο LKB III ημίλεπτες τομές του ιστού, πάχους 1 μm, για να εκτιμηθεί ιστολογικά η περιοχή της βιοψίας, και στη συνέχεια κόβονταν ημίλεπτες τομές ίδιου πάχους από περιοχές που στο μεγαλύτερο μέρος τους είχαν καρκινικά κύτταρα. Οι τομές αυτές του ιστού τοποθετούνταν σε αντικειμενοφόρες πλάκες καλυμμένες με poly-L-λυσίνη (#P 8920, Sigma, USA), ώστε να αποφευχθεί η αποκόλληση των τομών κατά την ανοσοϊστοχημική διαδικασία.27 Η κάλυψη των αντικειμενοφόρων πλακών γινόταν με υδατικό διάλυμα poly-L-λυσίνης (1:10), σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρείας.

Ανοσοϊστοχημεία

Στις ημίλεπτες τομές εποξικών ρητινών εφαρμόστηκε η έμμεση μέθοδος δύο βημάτων της ανοσοϋπεροξειδάσης.28,29 Όλα τα βήματα της ανοσοϊστοχημικής μεθόδου πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου, εκτός από το βήμα της επώασης στο πρωτογενές αντίσωμα.

Λόγω της υδρόφοβης φύσης των εποξικών ρητινών (που καθιστά δύσκολη την πρόσβαση των ανοσοϊστοχημικών αντιδραστηρίων στον ιστό), πριν από την εφαρμογή της ανοσοϊστοχημικής μεθόδου γινόταν χημική διάβρωση των τομών, με εμβάπτισή τους σε κορεσμένο αλκοολικό διάλυμα αιθοξειδίου του νατρίου, για 10 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια γινόταν (α) σταδιακή ενυδάτωση των τομών με εμβάπτισή τους σε 100%, 90%, 70%, 50% υδατικά διαλύματα αιθυλικής αλκοόλης, για 5 min σε κάθε διάλυμα, και τελικά σε δισαπεσταγμένο νερό (dH2O), (β) απενεργοποίηση της ενδογενούς υπεροξειδάσης, με εμβάπτιση των τομών σε υδατικό διάλυμα 0,3% Η2Ο2 (#1.07210.1000, Merck, Germany) για 30 min, σε σκοτεινό μέρος, (γ) ξέπλυμα με dH2O (2x5 min) και στη συνέχεια με PBS, pH 7,4 (3x5 min), (δ) δέσμευση των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης με επώαση των τομών σε διάλυμα 20% ορού κουνελιού (#X 0902, DAKO, Denmark, σε PBS), (ε) επώαση με το πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα κυτοκερατίνης 8 (#C5301, Sigma, Germany) σε τελική αραίωση 1:20 σε PBS που περιείχε 1% λευκωματίνης ορού εμβρύου βοός (BSA) (#Α7638, Sigma, Germany), για 20 ώρες, στους 4 °C, (στ) ξέπλυμα με PBS (3x5 min), (ζ) επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (#P161, DAKO, Germany) σε τελική αραίωση 1:20 σε PBS, pH 7,4 για 1 ώρα, (η) ξέπλυμα με PBS (3x5 min), (θ) επώαση με το διάλυμα του χρωμογόνου 3,3΄-τετραϋδροχλωρική διαμινοβενζιδίνη (DAB) (#18865, Boehringer Ingelheim Bioproducts, Germany) 0,05% παρουσία 0,024% H2O2 (#1.07210.1000, Merck, Germany) για 7 min, (ι) ξέπλυμα με νερό βρύσης και στη συνέχεια με dH2O για 5 min, (ια) συμπληρωματική χρώση με αιματοξυλίνη Harris (#35194 6T, BDH, Germany) για 20 min, (ιβ) ξέπλυμα με dH2O, (ιγ) αφυδάτωση σε υδατικά διαλύματα αιθυλικής αλκοόλης 50%, 70%, 90%, για 3 min σε κάθε διάλυμα, και σε 100% αιθυλική αλκοόλη για 3 min, διαύγαση σε ξυλόλη και κάλυψη των τομών με DPX (#36029 4H, BDH, Germany). Η παρατήρηση των τομών γινόταν σε οπτικό μικροσκόπιο Zeiss Axiolab εφοδιασμένο με φακούς Zeiss Achroplan. Περιοχές καρκινικών κυττάρων καταγράφονταν με βιντεοκάμερα υψηλής ανάλυσης SONY CCD-IRIS, που ήταν προσαρμοσμένη στο οπτικό μικροσκόπιο, και οι εικόνες αποθηκεύονταν σε Η/Υ Pentium II 350 MHz. Η εκτύπωση των εικόνων γινόταν σε εκτυπωτή Hewlett-Packard Color LaserJet 4.500 υψηλής ανάλυσης.

Μάρτυρες

Για τον έλεγχο της ειδικότητας της ανοσοϊστοχημικής αντίδρασης χρησιμοποιήθηκαν αρνητικοί μάρτυρες, δηλαδή κατά την εφαρμογή της ανοσοϊστοχημικής αντίδρασης είχε παραλειφθεί το βήμα της επώασης των τομών του ιστού με το πρωτογενές αντίσωμα.

Σύστημα ανάλυσης εικόνας – Μορφομετρία

Για τη μορφομετρική μελέτη των καρκινικών κυττάρων και την αξιολόγηση του βαθμού έκφρασης της κυτοκερατίνης 8 (Κ8) σε αυτά, γινόταν ψηφιακή ανάλυση εικόνων του υλικού. Ειδικότερα, εικόνες καρκινικών κυττάρων, μετά από παρατήρηση με τον αντικειμενικό καταδυτικό φακό 100΄, καταγράφονταν με βιντεοκάμερα SONY CCD-IRIS υψηλής ανάλυσης, προσαρμοσμένη στο οπτικό μικροσκόπιο, και επεξεργάζονταν ψηφιακά σε Η/Υ Pentium II 350 MHz, με χρήση του ειδικού προγράμματος μορφομετρίας Image-Pro Plus 3.1 της Media Cybernetics. Συγκεκριμένα, στην κάθε εικόνα, με ειδικό σύστημα μακροεντολών, γινόταν (α) αυτόματη βαθμονόμηση του φωτισμού της, (β) μετατροπή της εικόνας σε διαβάθμιση του γκρι (0–256), (γ) βαθμονόμηση της κλίμακας της οπτικής πυκνότητας (ΟΠ) με βάση την ελάχιστη και μέγιστη φωτεινότητα της ασπρόμαυρης εικόνας, (δ) ορισμός και μέτρηση του εμβαδού του καρκινικού κυττάρου και του εμβαδού του πυρήνα, για να βρεθεί το εμβαδόν του κυτταροπλάσματος και (ε) αυτόματη μέτρηση της μέσης ΟΠ στο καθορισμένο κυτταρόπλασμα, που αντιπροσωπεύει το βαθμό αντίδρασης ως προς την Κ8. Από κάθε περίπτωση γινόταν μέτρηση της κυτταροπλασματικής ΟΠ σε 50 καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων καταχωρούνταν αυτόματα και επεξεργάζονταν σε λογιστικά φύλλα στο πρόγραμμα Excel. Οι ίδιες μετρήσεις γίνονταν και στα νεοπλασματικά επιθηλιακά κύτταρα των ινοαδενωμάτων.

Στατιστική ανάλυση

Στην παρουσίαση των αποτελεσμάτων, η ομάδα των ινοαδενωμάτων χαρακτηρίστηκε ως «βαθμός κακοήθειας 0», σε αντιπαράθεση με τους βαθμούς κακοήθειας Ι, ΙΙ και ΙΙΙ, των πορογενών διηθητικών καρκινωμάτων του μαστού που μελετήθηκαν. Η στατιστική ανάλυση διενεργήθηκε με το στατιστικό πακέτο SAS. Χρησιμοποιήθηκε λογαριθμικός μετασχηματισμός των μετρήσεων της ΟΠ για την επίτευξη κανονικότητας. Για τη διερεύνηση της διαφοράς των ΟΠ στη λογαριθμική κλίμακα μεταξύ των διαφόρων βαθμών κακοήθειας των νεοπλασμάτων χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο τυχαίων επιδράσεων (Random effects models).30 Σε αυτό το μοντέλο λαμβάνεται υπόψη το γεγονός ότι πολλαπλά κύτταρα προέρχονται από το ίδιο άτομο. Περαιτέρω, με τη μέθοδο πολλαπλών συγκρίσεων του Scheffe31 έγιναν ανά δύο συγκρίσεις μεταξύ των βαθμών κακοήθειας. Όλα τα αναφερόμενα παρατηρούμενα επίπεδα σημαντικότητας (P-values) είναι αμφίπλευρα. Στατιστική σημαντικότητα αναφέρεται όταν P<0,05.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Στα πορογενή διηθητικά καρκινώματα μαστού που μελετήθηκαν, η αδενική διαφοροποίηση μειωνόταν όσο αύξανε ο βαθμός κακοήθειας του καρκινώματος. Τα καρκινικά κύτταρα, διαταγμένα σε μεγάλες ή μικρές στρογγυλές ή ταινιοειδείς αθροίσεις, χαρακτηρίζονταν από ποικιλία σε μέγεθος και σχήμα. Οι πυρήνες τους ήταν μεγάλοι, συχνά με πυρηνίσκους και πολύμορφοι. Στα καλοήθη νεοπλάσματα που μελετήθηκαν, τα επιθηλιακά κύτταρα ήταν πιο ομοιόμορφα, με μικρότερους πυρήνες και χωρίς μιτώσεις. Η αρχιτεκτονική δομή του ιστού ήταν πιο καλά διατηρημένη.

Ανοσοϊστοχημεία

Σε όλες τις περιπτώσεις πορογενών διηθητικών καρκινωμάτων μαστού που μελετήθηκαν, η κυτοκερατίνη 8 (Κ8) εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων. Και στους τρεις βαθμούς κακοήθειας, δηλαδή στα grade I, grade II και grade III, παρατηρήθηκε διαβάθμιση της αντίδρασης ως προς την Κ8 στα καρκινικά κύτταρα κάθε περίπτωσης. Συγκεκριμένα, σε ομάδες καρκινικών κυττάρων, κάποια κύτταρα είχαν έντονη αντίδραση ως προς την Κ8 στο κυτταρόπλασμά τους (εικόνες 1, 2), άλλα είχαν μέτρια αντίδραση (εικ. 3), ενώ γειτονικά τους κύτταρα ήταν αρνητικά ως προς την Κ8 (εικόνες 2, 3).

Από τη μελέτη της ανοσοϊστοχημικής εντόπισης της Κ8 στα καρκινικά κύτταρα των πορογενών διηθητικών καρκινωμάτων μαστού, παρατηρήθηκαν οι εξής τύποι αντίδρασης:

α. Έντονη αντίδραση της Κ8 ομοιόμορφα κατανεμημένη σε όλη την έκταση του κυτταροπλάσματος του καρκινικού κυττάρου (εικόνες 1, 2)

β. Μέτρια αντίδραση της Κ8 ομοιόμορφα κατανεμημένη σε όλη την έκταση του κυτταροπλάσματος του καρκινικού κυττάρου (εικόνες 2, 3)

γ. Έντονη έκφραση της Κ8 στην περιφέρεια του κυτταροπλάσματος και γύρω από τον πυρήνα του καρκινικού κυττάρου (εικ. 4)

δ. Έντονες και μεγάλες εστιακές εναποθέσεις της Κ8 κυρίως στην περιφέρεια του κυτταροπλάσματος, αλλά και μικρότερες εστιακές εναποθέσεις της Κ8 κατανεμημένες σε όλη την έκταση του κυτταροπλάσματος του καρκινικού κυττάρου (εικ. 5)

ε. Έντονη έκφραση της Κ8 γύρω από κυτταροπλασματικά κυστίδια. Σε ορισμένα από αυτά η αντίδραση δεν ήταν ομοιόμορφα κατανεμημένη, ενώ γύρω από άλλα κυστίδια η αντίδραση ήταν αρνητική (εικ. 6).

Στα καλοήθη νεοπλάσματα, η αντίδραση ως προς την Κ8 στο κυτταρόπλασμα των πιο καλά διαφοροποιημένων κυττάρων ήταν εντονότερη και πιο ομοιογενής (εικ. 7). Στις περιπτώσεις όπου είχε παραλειφθεί το πρωτογενές αντίσωμα (αρνητικοί μάρτυρες), δεν παρατηρήθηκε αντίδραση (εικ. 8).

Στατιστική

Περιγραφικά στατιστικά μέτρα των ΟΠ (μέσος±τυπική απόκλιση) ανά άτομο και συνολικά για κάθε βαθμό κακοήθειας παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Στην εικόνα 9, δίνεται ένα διάγραμμα πλαισίου-απολήξεων της κατανομής του λογαρίθμου των ΟΠ ανά βαθμό κακοήθειας. Βρέθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά των ΟΠ στη λογαριθμική κλίμακα (P=0,0001) μεταξύ των διαφορετικών ομάδων βαθμών κακοήθειας (0, Ι, ΙΙ και ΙΙΙ). Ειδικότερα, βάσει της μεθόδου πολλαπλών συγκρίσεων του Scheffe, βρέθηκε ότι ο λογάριθμος των ΟΠ κατά μέσο όρο διαφέρει στατιστικώς σημαντικά μεταξύ των ομάδων βαθμού κακοήθειας ΙΙ και 0 (P= 0,032), καθώς και μεταξύ των ομάδων βαθμού κακοήθειας ΙΙΙ και 0 (P=0,0003), ενώ απέχει ελάχιστα από τα επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας η διαφορά μεταξύ βαθμού κακοήθειας Ι και 0 (P=0,067). Μη στατιστικώς σημαντικές ήταν οι διαφορές μεταξύ των διαφόρων βαθμών κακοήθειας (P=0,995, P=0,461 και P=0,621, για τη σύγκριση Ι έναντι ΙΙ, Ι έναντι ΙΙΙ και ΙΙ έναντι ΙΙΙ, αντίστοιχα).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Στην εργασία αυτή γίνεται με επιτυχία ανοσοεντόπιση της Κ8 με χρήση DAB ως χρωμογόνου, σε ημίλεπτες τομές από πορογενή διηθητικά καρκινώματα μαστού.

Η επιτυχία της ανοσοϊστοχημικής μεθόδου που εφαρμόζεται εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το είδος του μονιμοποιητικού μέσου που χρησιμοποιείται, από το χρόνο μονιμοποίησης του ιστού και από το μέγεθος του ιστοτεμαχίου που πρόκειται να μονιμοποιηθεί, με σκοπό τη διατήρηση της καλής μορφολογίας του ιστού, αλλά και της αντιγονικότητάς του,32,33 ώστε να μην καλύπτονται οι διαθέσιμες αντιγονικές θέσεις με την ανάπτυξη πλευρικών δεσμών γύρω από αυτές.34 Σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία, η χρήση φορμόλης ως μονιμοποιητικού μέσου έχει αρνητική επίδραση στην ανοσοεντόπιση αντιγονικών θέσεων σε μόρια κυτοκερατινών και άλλων βιομορίων, με αποτέλεσμα να απαιτείται η χρήση πρωτεϊνασών για την αποκάλυψη των αντιγονικών θέσεων.35,36

Στην παρούσα εργασία, το μικρό μέγεθος των ιστοτεμαχίων (1–1,5 mm3), που μονιμοποιούνταν σε σχετικά μεγάλη συγκέντρωση γλουταραλδεΰδης (2,5%) για 1 ώρα στους 4 °C, εξασφάλισε την καλή διατήρηση της μορφολογίας του ιστού, αλλά ταυτόχρονα και την αντιγονικότητά του ως προς την Κ8, με αποτέλεσμα να αποδοθεί λεπτομερής ανοσοεντόπιση.

Πριν από την εφαρμογή ανοσοϊστοχημικής μεθόδου σε ημίλεπτες τομές εποξικών ρητινών, είναι απαραίτητη η επώαση των τομών με κατάλληλο μέσο, ώστε να διαβρωθεί το πολυμερές των ρητινών και να είναι δυνατή η διείσδυση των ανοσοϊστοχημικών αντιδραστηρίων στον ιστό. Η χρονική διάρκεια όμως της επώασης αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για την επιτυχή έκβαση της ανοσοϊστοχημικής αντίδρασης, γιατί η μακρόχρονη επώαση καταστρέφει τη μορφολογία του ιστού, ενώ η βραχύχρονη δεν αφαιρεί ολοκληρωτικά τη ρητίνη, επηρεάζοντας αρνητικά το βαθμό της ανοσοαντίδρασης. Στην παρούσα εργασία, η επώαση των ημίλεπτων τομών, πάχους 1 μm, σε κορεσμένο αλκοολικό διάλυμα αιθοξειδίου του νατρίου για 10 min, έδωσε τα καλύτερα ανοσοϊστοχημικά αποτελέσματα.

Η επεξεργασία και η προετοιμασία του υλικού που χρησιμοποιήθηκε επιτρέπει τη μορφολογική και ανοσοϊστοχημική μελέτη του ίδιου υλικού και σε υπερμικροσκοπικό επίπεδο, με παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης. Έτσι, μπορεί να γίνει άμεση σύγκριση του ανοσοϊστοχημικού εντοπισμού της Κ8 σε διαδοχικά γειτονικές ημίλεπτες και υπέρλεπτες τομές του ιστού και η συσχέτισή της με υπερμικροσκοπικές δομές. Επομένως, είναι δυνατός ο ακριβής εντοπισμός της Κ8 στα πορογενή διηθητικά καρκινώματα μαστού.

Η ψηφιακή ανάλυση εικόνας χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο στην παθολογική ανατομική και στην ιστολογία για τη μέτρηση και αξιολόγηση μορφολογικών και οπτικών παραμέτρων σε ιστολογικά παρασκευάσματα, κατάλληλα ιστοχημικά ή ανοσοϊστοχημικά χρωματισμένα.22 Στον καρκίνο του μαστού, η ανοσοεντόπιση βιολογικών δεικτών και η μελέτη τους με ψηφιακό σύστημα ανάλυσης εικόνας δίνει τη δυνατότητα αντικειμενικής και επαναλαμβανόμενης εκτίμησης και αξιολόγησης των αποτελεσμάτων, έτσι ώστε να επιτυγχάνεται ακριβέστερη διάγνωση και πρόγνωση.23,25,37 Από τις μετρήσεις, με το ψηφιακό σύστημα ανάλυσης εικόνας, των κυτταροπλασματικών ΟΠ στα καρκινικά κύτταρα των πορογενών διηθητικών καρκινωμάτων μαστού που μελετήθηκαν, γίνεται φανερή η ετερογένεια στην έκφραση της Κ8, τόσο σε επίπεδο περίπτωσης, από τη μεγάλη τυπική απόκλιση των τιμών, όσο και μεταξύ των περιπτώσεων που ανήκουν στον ίδιο βαθμό κακοήθειας. Αντίθετα, στα μελετηθέντα καλοήθη νεοπλάσματα (ινοαδενώματα) η τυπική απόκλιση δεν είναι τόσο μεγάλη και οι τιμές των ΟΠ μεταξύ των περιπτώσεων είναι πιο ομοιόμορφες.

Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι, μεταξύ των βαθμών κακοήθειας των περιπτώσεων του πορογενούς διηθητικού καρκινώματος μαστού που μελετήθηκαν, δεν υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά στην έκφραση της Κ8. Το δεδομένο αυτό έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενη μελέτη των Heatley et al (1995),38 στην οποία έγινε συγκριτική μελέτη της έκφρασης των κυτοκερατινών με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους σε καλοήθη και κακοήθη νεοπλάσματα του μαστού. Οι ερευνητές αυτοί κατέληξαν στο συμπέρασμα, μεταξύ άλλων, ότι, αυξανομένου του βαθμού κακοήθειας στα συγκεκριμένα νεοπλάσματα, η μεταβολή της έκφρασης των κυτοκερατινών –όπου παρατηρείται– δεν είναι στατιστικώς σημαντική.

Επομένως, από τα μέχρι τώρα αποτελέσματα φαίνεται ότι, αφενός μεν ο βαθμός έκφρασης της Κ8 δεν αποτελεί ασφαλή δείκτη για την εκτίμηση του βαθμού κακοήθειας στα πορογενή διηθητικά καρκινώματα του μαστού και αφετέρου μπορεί να αποτελέσει ασφαλή δείκτη διάκρισης μεταξύ κακοήθειας και καλοήθειας. Ο δείκτης αυτός θα μπορούσε μελλοντικά να χρησιμοποιηθεί για διαγνωστικές διαδικασίες και προς την κατεύθυνση αυτή πιστεύεται ότι θα βοηθήσει αποτελεσματικά η ολοκλήρωση της μελέτης στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Η παρούσα εργασία χρηματοδοτήθηκε από τον ΕΛΚΕ του Πανεπιστημίου Αθηνών (κωδ. 70/4/3495) και από την Ερευνητική Επιχορήγηση Ακαδημαϊκού Έτους 1999 της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών (έτους 1999) για την ενίσχυση ερευνητικών προγραμμάτων. Οι συγγραφείς εκφράζουν τις ευχαριστίες τους στον ιατρό κ. Στ. Βασίλαρο, άμισθο επίκουρο καθηγητή της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών, για την προσφορά του υπό μελέτη υλικού από το Ιατρικό Κέντρο Διάγνωσης και Παρακολούθησης «Πρόληψις», την καθηγήτρια κα Μ. Ισιδωρίδου, υπεύθυνη της Ερευνητικής Μονάδας Ιστοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας της Ψυχιατρικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών στο Αιγινήτειο Νοσοκομείο, για την παραχώρηση του υπερμικροτόμου, τη στατιστικό κα Χρ. Σωτηροπούλου, για τη διεξοδική επεξεργασία και στατιστική ανάλυση των δεδομένων, και την τεχνολόγο του Παθολογοανατομικού Εργαστηρίου του Ευγενίδειου Θεραπευτηρίου κ. Α. Στεργιώτη, για την αμέριστη και ουσιαστική βοήθεια στη συλλογή του υπό μελέτη υλικού. Τέλος, οι συγγραφείς ευχαριστούν θερμά την εταιρεία συστημάτων ανάλυσης ψηφιακής εικόνας Digital Image Systems για την άψογη τεχνική υποστήριξη του υπολογιστικού συστήματος μορφομετρίας και ανάλυσης εικόνας, καθώς και για τον προγραμματισμό των μακροεντολών.

Πηγές ενίσχυσης: Ειδικός Λογαριασμός Κονδυλίων Έρευνας (ΕΛΚΕ) (κωδ. 70/4/3495) και Ερευνητική Επιχορήγηση Ακαδημαϊκού Έτους 1999, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Αθηνών

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

  1. Franke WW, Schiller DL, Moll R, Winter S, Schmid E, Engelbrecht I et al. Diversity of cytokeratins. Differentiation specific expression of cytokeratin polypeptides in epithelial cells and tissues. J Mol Biol 1981, 153:933–959
  2. Franke WW, Schiller DL, Hatzfeld M, Winter S. Protein complexes of intermediated-sized filaments. Melting of cytokeratin complexes in urea reveals different polypeptide separation characteristics. Proc Natl Acad Sci USA 1983, 80:7113–7117
  3. Moll R, Franke WW, Schiller DL, Geiger B, Krepler R. The catalog of human cytokeratin polypeptides. Patterns of expression of specific cytokeratins in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell 1982, 31:11–24
  4. Moll R, Schiller DL, Franke WW. Identification of protein IT of intestinal cytoskeleton as a novel type I cytokeratin with unusual properties and expression patterns. J Cell Biol 1990, 111: 567–580
  5. Kim KH, Rheinwald JG, Fuchs E. Tissue specificity of epithelial keratins. Differential expressions of mRNAs from two multigene families. Mol Cell Biol 1983, 3:495–502
  6. Kim KH, Marchuk D, Fuchs E. Expression of unusually large keratins during terminal differentiation. Balance of type II keratins is not disrupted. J Cell Biol 1984, 99:1872–1877
  7. Fuchs E, Coppock SM, Green H, Cleveland DW. Two distinct classes of keratin genes and their evolutionary significance. Cell 1981, 27:75–84
  8. Franke WW, Schmid E, Weber K, Osborn M. HeLa cells contain intermediate-sized filaments of the prekeratin type. Exp Cell Res 1979, 118:95–109
  9. Wu YJ, Rheinwald JG. A new small (40 kd) keratin filament protein made by some cultured human squamous cell carcinomas. Cell 1981, 25:627–635
  10. Battifora H. The biology of the keratins and their diagnostic applications. In: DeLellis RA (ed) Advances in Immunohistochemistry. Raven Press, New York, 1988:191–221
  11. Takei H, Iino Y, Horiguchi J, Kanoh T, Takao Y, Oyama T et al. Immunohistochemical analysis of cytokeratin 8 as a prognostic factor in invasive breast carcinoma. Anticancer Res 1995, 15:1101– 1106
  12. Visscher D, Zarbo RJ, Crissman JD. Application of monoclonal antibodies to high and low molecular weight cytokeratins in the differential diagnosis of human carcinomas. Surg Pathol 1988, 1:407–416
  13. Trask DK, Band V, Zajchowski DA, Yaswen P, Suh T, Sager R. Keratins as markers that distinguish normal and tumor-derived mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 2319–2323
  14. Nagle RB. Intermediate filaments. A review of basic biology. Am J Surg Pathol 1988, 12(Suppl 1):4–16
  15. Shah KD, Tabibzadeh SS, Gerber MA. Comparison of cytokeratin expression in primary and metastatic carcinomas. Diagnostic application in surgical pathology. Am J Clin Pathol 1987, 87:708–715
  16. Hembrough TA, Vasudevan J, Allietta MM, Glass WF II, Gonias SL. A cytokeratin 8-like protein with plasminogen-binding activity is present on the external surfaces of hepatocytes, HepG2 cells and breast carcinoma cell lines. J Cell Sci 1995, 108:1071–1082
  17. Hembrough TA, Kralovich KR, Li L, Gonias SL. Cytokeratin 8 released by breast carcinoma cells in vitro binds plasminogen and tissue-type plasminogen activator and promotes plasminogen activation. Biochem J 1996, 317:763–769
  18. Hembrough TA, Li L, Gonias SL. Cell-surface cytokeratin 8 is the major plasminogen receptor on breast cancer cells and is required for the accelerated activation of cell-associated plasminogen by tissue-type plasminogen activator. J Biol Chem 1996, 271:25684–25691
  19. Kralovich KR, Li L, Hembrough TA, Webb DJ, Karns LR, Gonias SL. Characterization of the binding sites for plasminogen and tissue-type plasminogen activator in cytokeratin 8 and cytokeratin 18. J Protein Chem 1998, 17:845–854
  20. Godfroid E, Geuskens M, Dupressoir T, Parent I, Szpirer C. Cytokeratins are exposed on the outer surface of established human mammary carcinoma cells. J Cell Sci 1991, 99:595–607
  21. Chan R, Rossitto PV, Edwards BF, Cardiff RD. Presence of proteolytically processed keratins in the culture medium of MCF-7 cells. Cancer Res 1986, 46:6353–6359
  22. Mayr NA, Staples JJ, Robinson RA, Vanmetre JE, Hussey DH. Morphometric studies in intraductal breast carcinoma using computerized image analysis. Cancer 1991, 67:2805–2812
  23. Querzoli P, Ferretti S, Albonico G, Rinaldi R, Magri E, Scapoli D et al. Application of quantitative analysis to biologic profile eva-luation in breast cancer. Cancer 1995, 76:2510–2517
  24. Tuczek HV, Fritz P, Schwarzmann P, Wu X, Mahner G. Correlations between visual diagnostic criteria for histologic grading and features of image analysis. Analyt Quant Cytol Histol 1996, 18:481–493
  25. Querzoli P, Albonico G, Ferretti S, Rinaldi R, Magri E, Nenci I. Quantitative immunoprofiles of breast cancer performed by image analysis. Analyt Quant Cytol Histol 1999, 21:151–160
  26. Pickel VM, Joh TH, Reis DJ. Monoamine-synthesizing enzymes in central dopaminergic, noradrenergic and serotonergic neurons. Immunocytochemical localisation by light and electron microscopy. J Histochem Cytochem 1976, 24:792–806
  27. Huang WM, Gibson S, Facer P, Gu J, Polak JM. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry 1983, 77:275–279
  28. Lane BP, Europa DL. Differential staining of ultrathin sections of epon-embedded tissue for light microscopy. J Histochem Cyto-chem 1965, 13:579–582
  29. Nakane PK, Pierce GB. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen. J Histochem Cyto-chem 1966, 14:929–931
  30. Laird NM, Lange N, Stram D. Maximum likelihood computations with repeated measures: application of the EM algorithm. J Am Statistical Assoc 1987, 82:97–105
  31. Scheffe H. A method for judging all contrasts in the analysis of variance. Biometrika 1953, 40:87–104
  32. Berod A, Hartman BK, Pujol JF. Importance of fixation in immunohistochemistry: use of formaldehyde solutions at variable pH for the localization of tyrosine hydroxylase. J Histochem Cytochem 1981, 29:844–850
  33. Χαβάκη Σ, Αρβανίτης Δ, Κίττας Χ, Μαρίνος Ε. Τεχνικές επισημάνσεις για την εφαρμογή ειδικών ανοσοϊστοχημικών τεχνικών στο οπτικό και στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Ιπποκράτης 1998, 6:64–67
  34. Battifora H, Kopinski M. The influence of protease digestion and duration of fixation on the immunostaining of keratins. J Histo-chem Cytochem 1986, 34:1095–1100
  35. Battifora H. Recent progress in the immunohistochemistry of solid tumors. Semin Diagn Pathol 1985, 1:251–271
  36. Nagle RB, McDaniel KM, Clark VA, Payne CM. The use of antikeratin antibodies in the diagnosis of human neoplasms. Am J Clin Pathol 1983, 79:458–466
  37. Wells WA, Rainer AR, Memoli U. Equipment, standardization, and application of image processing. Am J Clin Pathol 1993, 99:48– 56
  38. Heatley M, Maxwell P, Whiteside C, Toner P. Cytokeratin intermediate filament expression in benign and malignant breast disease. J Clin Pathol 1995, 48:26–32

 

© 2001, Αρχεία Ελληνικής Ιατρικής